猪囊尾蚴病患者CD4+CD25+调节性T细胞水平的变化

王雪梅，王 英，方 强，孙 新，焦玉萌，常雪莲，夏 惠

猪带绦虫的幼虫囊尾蚴可寄生于人体引起猪囊尾蚴病。猪囊尾蚴病的免疫反应十分复杂，机体一旦感染猪囊尾蚴，其免疫状态就会发生相应的变化，多种免疫细胞及免疫分子将参与猪囊尾蚴病的免疫调控。CD4+CD25+调节性T 细胞(regulatory T cells，Tregs)是体内天然存在的具有独特调节功能的细胞亚群［1］。调节性T 细胞参与几乎全部的寄生虫病免疫反应，是寄生虫感染免疫调节的重要环节［2-3］。为了了解CD4+CD25+调节性T 细胞在猪囊尾蚴病发病机制中的作用，我们采用流式细胞仪检测猪囊尾蚴病患者外周血中CD4+CD25+调节性T 细胞的百分含量，以期进一步认识囊尾蚴感染引起的免疫特征，对阐明猪囊尾蚴病的致病机制及制定免疫预防和治疗策略将会有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 标本:静脉血2 ml，肝素抗凝。11 例患者来自蚌医附院收治的初诊患者，其中男8 例，女3 例，年龄14～40 岁，患者经CT 或MRI 以及免疫学方法确诊为猪囊尾蚴病，脑CT 显示病灶为单发或多发的低密度环形阴影，并排除了合并其他感染、变态反应性及免疫性疾病。正常对照组:本院健康教职工14 例，其中男4 例，女10 例，年龄24～50 岁，近期无服药史及感染史。主要试剂:荧光标记抗体:抗人CD25-PE(Immunotech，法国)，抗人FOXP3-FITC、抗人CD4-PE-CY5(Caltag，美国);多聚甲醛(PFA)、皂角素(Saponin)为Sigma 公司产品。主要仪器:流式细胞仪，FACS Calibur(BD 公司);低温离心机(Eppendorf 5810R 型，德国);垂直层流工作台。

1.2 实验方法 采用直接荧光标记法测定CD4+CD25+调节性T 细胞的百分含量，并分析CD4+CD25+T 细胞中表达FOXP3 的细胞比例。取流式染色管2 支，每支加入全血50 μL 后加入2 μL 抗人CD25PE、5 μL 抗人CD4PE-CY5，室温避光30 min，加溶血素3 ml 室温避光15 min ，800 g 离心5 min。弃上清，用染色缓冲液(含5%FCS ，0.1% NaN3的PBS)洗2次;加入200 mL 固定剂，室温避光30 min。取1 mL染色缓冲液800 g 离心5 min。加入500 μL 破膜剂再离心;然后加含有1 μ1 抗FOXP3 FITC 的破膜剂500 μL 后室温避光1 h。离心后弃上清并洗涤2 次，用200 μL 染色缓冲液重悬上机检测。每份标本同时设阴性对照及荧光补偿调节管。

1.3 统计学方法 采用t 检验。

2 结果

经检测，囊尾蚴病患者外周血中CD4+CD25+T 淋巴细胞的百分含量为6.11%，较正常人(3.94%)明显升高(P＜0.05);患者外周血中CD4+CD25+T 细胞表达FOXP3 的细胞百分含量为15.67%，与正常对照组(11.09%)有显著性差异(P＜0.05)，结果见表1。

表1 患者与对照组外周血CD4 +CD25 +T 细胞含量(%，±s)

表1 患者与对照组外周血CD4 +CD25 +T 细胞含量(%，±s)

组别例数 CD4 +CD25 +T cellsCD4 +CD25 + FOXP3+猪囊尾蚴病患者116.11 ±2.1415.67 ±6.98正常人143.94 ±1.9811.09 ±3.75 t 值－2.632.11 P 值－＜0.05＜0.05

3 讨论

许多病原体在感染过程中都会诱导机体产生免疫抑制状态，这不仅是病原体逃避宿主免疫应答的适应性机制，还可以防止机体在抗感染过程中由于产生过强的免疫应答而导致严重的病理损害［4］。调节性T 细胞可以控制寄生虫感染引发的免疫病理反应强度，从而限制对宿主的损害程度［5］。CD4+CD25+调节性T 细胞是近年研究较多的一群调节性T 细胞，己发现与各种感染性疾病关系密切。近年来有关CD4+CD25+调节性T 细胞的免疫作用已经成为研究热点［6-8］。CD25 也可以在其他活化的T 细胞表面表达，并非其特异性标志，但有研究表明转录因了FOXP3 可作为这群调节性T 细胞最可靠的标志［9］。在寄生虫方面的研究中发现CD4+CD25+调节性T 细胞在抑制对利什曼原虫、丝虫的杀伤作用中发挥重要作用［10-13］;体内抗CD25 单克隆抗体阻断实验显示，移除CD4+CD25+T 细胞可以保护易感BALB/c 小鼠对致死性约氏疟原虫的攻击，该保护作用与特异性T 细胞免疫应答有关，提示CD4+CD25+T 细胞在疟疾感染过程中可能发挥免疫抑制作用［14-15］。研究还发现CD4+CD25+调节性T 细胞在血吸虫卵导致肉芽肿形成中起着重要作用［16］。

本研究对猪囊尾蚴病患者外周血中CD4+CD25+T 细胞以及此群体中FOXP3+T 细胞百分比进行了测定。结果显示:CD4+CD25+T 细胞在猪囊尾蚴病初诊患者外周血中比例明显升高，其中表达FOXP3 的细胞群体的比例也明显升高，这提示CD4+CD25+FOXP3+T 细胞在猪囊尾蚴感染中可能参与了机体的免疫调节。下一步拟用患者外周血与CD4+CD25+调节性T 细胞共培养，检测其抑制功能;同时准备用流式细胞仪检测患者CD4+CD25+调节性T 细胞合成Th1/Th2 的影响与变化。只有充分认识CD4+CD25+调节性T 细胞在猪囊尾蚴感染过程中发挥的免疫效应，特别是阐明其免疫调节作用的发生和调控机理，才能会对研制和开发有效的疫苗和设计有效的抗感染方案具有重要的科学意义。

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