小麦蛋白酶解物制备热反应型肉香调味基料的研究

刘丽娅 孙梦颖 王延州 钟 葵 佟立涛 朱 捷 周素梅

（农业部农产品加工重点实验室中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

热反应香精是利用氨基酸、多肽等蛋白质水解物与还原糖、脂类等在一定条件下加热发生美拉德反应（Maillard Reaction，MR）生成的风味物质。香料工业界从20世纪中叶起就开始采用热反应的方法合成增香调味品。

目前用于热反应香精制备的蛋白水解物多为豆粕、花生粕等通过化学或酶法得到的水解产物，对价格低廉、来源丰富的小麦面筋蛋白的研究利用却相对较少［1－3］。事实上，小麦面筋蛋白的氨基酸组成中含有大量的谷氨酸和脯氨酸，一级结构中富含呈味肽序列［4］。因此，可作为美拉德反应有效的氨基酸来源。其氨基酸组成中半胱氨酸、甲硫氨酸不足的问题，亦可通过添加外加氨基酸来弥补［5］。

基于上述考虑，本研究选择低值小麦面筋蛋白为原料，利用控制条件下的糖与蛋白质水解物发生Maillard反应，合成咸味香精，并通过固相微萃取－气相色谱－质谱联用技术（SPME－GC－MS）分析了肉香产物。该研究对于拓宽小麦面筋蛋白的应用范围，增加附加值、推动小麦淀粉及肉味香精产业的发展－具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

小麦面筋蛋白（蛋白质量分数70．3%）：山东省滨州泰裕麦业有限公司；Flavourzyme 1000L风味蛋白酶：酶活力1 000 LAPU／g，诺维信（中国）生物技术有限公司。

其他试剂均为分析纯。

1．2 主要仪器与设备

UB－7型酸度计、T－214电子分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司；2300自动定氮仪：瑞典FOSS公司；Anke LXJ－IIB离心机：上海安亭科学仪器厂；THZ－82A水浴恒温振荡器：江苏荣华仪器制造有限公司。

1．3 方法

1．3．1 小麦面筋蛋白深度酶解产物（E－WHP）的制备

称取20 g小麦面筋蛋白，边搅拌边加入一定量的去离子水中，室温下搅拌30 min，得到10%的底物悬浮液。用1 mol·L－1的NaOH或HCl溶液调节pH至6．0，预热至55℃后，加入Flavourzyme风味酶，酶与蛋白比例1∶100，在摇床中恒温振荡，反应12 h后，将酶解液置于95℃水浴中，保持10 min灭酶。之后用冰水浴迅速冷却，离心（4 000 r／min，20 min）得上清液，冷冻干燥得到产品（E－WHP）。

1．3．2 蛋白回收率的测定

蛋白回收率采用下式计算，蛋白含量采用凯氏定氮法测定（GB／T 14771—2003）。

式中：原料小麦面筋蛋白的蛋白质量分数为70．3%。

1．3．3 水解度的测定［6－7］

水解度的测定采用甲醛滴定法。具体方法：首先采用甲醛滴定法测定样品中的—NH2或—COOH基团的含量，然后代入下式求得其水解度。

式中：h为采用甲醛滴定法测定酶解液中的—NH2或—COOH基团的含量／mmol／g；h0为采用甲醛滴定法测定的水解前原料中的—NH2或—COOH基团的含量／mmol／g；htot为每克原料蛋白的肽键毫摩尔数／mmol／g，对于小麦面筋蛋白，htot＝8．38 mmol／g。

1．3．4 美拉德反应制备肉香调味基料工艺条件的优化

取经冷冻干燥后的小麦面筋蛋白水解液加去离子水溶解，加入木糖、L－半胱氨酸，搅拌均匀后置于25 mL具塞试管，封口后置于烘箱中加热。反应结束后，使反应液迅速冷却并于4℃冰箱下保存。通过对反应产物的风味进行评价，分别确定最佳反应pH、温度、pH和各组分的添加量。在单因素试验基础上，采用正交试验确定最佳制备工艺。

1．3．5 美拉德反应产物风味的评定

由9人组成感官评定小组，对美拉德反应产物分别进行气味和可接受性评分。采用7分制，总分为2个指标分值之和，最高分126分，最低分14分，得出最终感官评分分值。评价标准见表1。

表1 美拉德反应产物的气味和喜性评分标准

1．3．6 美拉德反应褐变程度的测定

美拉德反应往往伴随着褐变现象，褐变程度是衡量美拉德反应进程最简便的方法。将褐变反应液经12 000 r／min离心15 min，除去反应产生的不溶物质，取所有样品上清液稀释10倍，在420 nm波长下，测定吸光值（OD420）。

1．3．7 SPME－GC－MS对挥发性风味成分的检测

SPME装置：自动进样装置，萃取头为聚二甲基硅烷／二乙烯苯碳（PDMS／DVB，涂层厚度 65μm），均购于Supelco公司（美国）。

SPME萃取条件：样品2 mL，萃取头加热搅拌顶空萃取，萃取温度60℃，平衡时间20 min，萃取时间30 min，振荡萃取频率 250 r／min。

GC条件：色谱柱为HP－5MS毛细管柱（30 m×0．25 mm×0．25μm），程序升温：柱初温 50℃，保持3 min，以5℃／min升温至280℃，保持2 min。进样口温度为280℃；热解析2 min；载气：氦气，流量1 mL／min，不分流模式进样。

MS条件：电离源能量为70 eV，离子源温度280℃，传输线温度250℃，采用scan模式分析。

对样品进行GC－MS分析后，用气相色谱－质谱－计算机联用技术检测得到美拉德产物中挥发性气体总离子图，各组分质谱经计算机谱库（NIST05、NIST05s）检索及相关文献分析，确认样品中各香气化合物成分，并应用峰面积归一化法测得各香气成分相对含量。

2 结果与讨论

2．1 小麦面筋蛋白的深度酶解

毛善勇等［8］采用小麦面筋蛋白酸水解产物制备肉味香精，但在酸水解高温强酸的条件下，会产生致癌性的1，3－二氯－2－丙醇（1，3－DCP）和3－氯 －1，2丙二醇（3－MCPD），对人体的肝、肾和神经系统有极大的损害［9－10］。

酶水解反应条件温和、可保持氨基酸不被破坏，其水解产物中只有氨基酸和多肽，不产生有毒有害物质。通过前期的研究筛选出风味酶对小麦面筋蛋白进行酶解，按照1．3．1中的方法，制备出富含氨基酸和多肽的水解产物，水解度为32．4%，蛋白利用率为87．2%，水解液澄清透明，带有轻微麦香味。

2．2 美拉德反应制备肉香调味基料工艺条件的优化

2．2．1 单因素试验

2．2．1．1 反应液初始pH值对香料基液风味和褐变程度的影响

将各试验材料按配比搅拌均匀（15%E－WHP、5%木糖、1% 半胱氨酸），调节pH，密封后于100℃下反应60 min，冷却后比较pH值对褐变程度和风味的影响。

体系褐变程度和感官评分随初始pH值的变化如图1所示。由图1可知，随着体系pH值的增加，褐变程度不断升高。这是因为在酸性溶液中，氨基处于质子化状态，抑制了葡基胺的形成。值得注意的是，当pH值升高到8时，褐变程度有所降低。刘通讯等［3］在利用花生粕蛋白酶解液合成肉类香味料的研究中也发现类似现象。另一方面，当初始pH＜4时，反应程度较低，无特征肉香风味；pH＞7时产生的风味较差；而当pH介于4～7之间，反应效果较好。

图1 pH值对美拉德产物感官评分及褐变程度的影响

2．2．1．2 温度对香料基液风味和褐变程度的影响

将试验材料按配比搅拌均匀（15%E－WHP、5%木糖、1%半胱氨酸），调节pH为7，密封后于不同外界温度下加热反应60 min，冷却后比较反应温度对褐变程度和感官评分的影响，结果见图2。

图2 温度对美拉德产物感官评分及褐变程度的影响

由图2可知，温度对美拉德反应进程影响显著。在一定范围内，褐变程度和感官评分值均随温度的升高不断增加；但温度达到145℃时，反应物褐变严重，体系出现焦糊味，肉香风味变差。这是因为美拉德反应是典型的热敏型反应，温度的升高增加了糖和氨基酸的活性，进而加快化学反应速度。因此，外界温度控制在115～130℃范围内所生成的肉味纯正浓郁。

2．2．1．3 反应时间对香料基液风味和褐变程度的影响

将试验材料按配比搅拌均匀（15%E－WHP、5%木糖、1% 半胱氨酸），调节pH为7，密封后于115℃下加热不同时间，冷却后比较反应时间对感观评分和褐变程度的影响，结果见图3。随着反应时间的延长，氨基酸和还原糖不断反应，美拉德反应越彻底，褐变程度越深，但是反应时间过长，感官评分值反而降低。

图3 反应时间对美拉德产物感官评分及褐变程度的影响

2．2．1．4 还原糖添加量对香料基液风味和褐变程度的影响

将试验材料按配比搅拌均匀（15%E－WHP、1%半胱氨酸），改变其中木糖的添加量，调节pH为7，密封后于115℃下加热60 min，冷却后比较木糖用量对风味和感官评分的影响。由图4可知，随着木糖用量的增加，褐变程度逐渐提高。但是感官评定结果表明，当木糖添加量增加至10%时，肉香味中带有较浓的焦糊味。

图4 木糖添加量对美拉德产物感官评分及褐变程度的影响

2．2．1．5 L－半胱氨酸添加量对香料基液风味和褐变程度的影响

将试验材料按配比搅拌均匀（15%E－WHP、1%半胱氨酸），改变其中L－半胱氨酸添加量。调节pH为7，密封后于115℃下加热60 min，冷却后比较半胱氨酸用量对风味和褐变程度的影响。

图5 半胱氨酸添加量对美拉德产物感官评分及褐变程度的影响

由图5可知，添加一定量半胱氨酸使体系的褐变程度大大降低，而感官评分值大大提高。这是因为含硫氨基酸通过美拉德反应所产生的含硫化合物、杂环化合物（包括含硫杂环化合物）是形成肉味香气的主要成分。小麦面筋蛋白本身含硫氨基酸很少，在外加半胱氨酸情况下，半胱氨酸经Strecker降解首先产生巯基乙醛，再继续分解产生乙醛和硫化氢，这些化合物在肉香风味的形成中起到关键作用［3］。继续提高半胱氨酸的用量，褐变程度和风味变化不大。

2．2．2 美拉德反应条件的正交优化

根据影响风味物质形成的主要因素，选择pH、温度（℃）、反应时间（min）、木糖和半胱氨酸添加量（g）作为影响因素，按 L16（45）表进行正交试验。以感官评分值为指标，采用SAS 8．0统计软件进行统计分析。试验结果和数据处理见表2、表3。

表2 5因素4水平正交试验结果

续表

表3 方差分析

从表2、表3可知，5个因素对美拉德产物的感官评分具有极显著的影响（P＜0．000 1），影响程度由大到小依次为A（pH）＞E（半胱氨酸添加量）＞B（温度）＞C（时间）＞D（木糖添加量）。极差分析结果表明美拉德反应的最佳工艺组合为：A3B3C4D4E4，即添加6%木糖和1．25% 半胱氨酸，pH 7、115℃，反应75 min。

2．2．3 美拉德反应产物GC－MS分析结果

采用相微萃取－气相－质谱技术对利用最佳工艺（15%E－WHP、6% 木糖、1．25% 半胱氨酸，pH7、115℃，反应75 min）制备得到的美拉德产物进行分析，其挥发性成分种类和相对含量如表4所示。从产物中共鉴定出46种风味化合物，主要成分有醛、酮、酚、有机酸类物质，以及个别呋喃、硫醇类、噻唑、噻吩。噻吩和硫醇类物质是已被证明的具有明显肉味特征的含硫化合物，特别是3位被硫醇取代的呋喃和噻吩［11－12］。在本试验中，2－甲基 －3－呋喃硫醇的相对含量较高，该化合物具有很高的风味释放因子，阈值非常低，仅为 0．005～0．010μg／kg［14］。同时，挥发性组分中的糠醛、糠硫醇也是重要的肉香味化合物，对产品风味的形成具有重要的作用；苯甲醛、壬醛分别具有苦杏仁味和油炸香，辛酸、壬酸、癸酸具有淡的水果香气，这些化合物可能对气味加成或协同作用的效果，也被认为是非常有效的风味修饰剂。此外，挥发性物质中4，5－二甲基－1，3－二氧杂环戊烯－2－酮含量较高的，该化合物在医药工业中被用作制备抗高血压药的中间体，在肉香风味的挥发物中并不多见，其形成机制有待于进一步研究。

表4 小麦面筋蛋白美拉德产物中挥发性风味成分的GC－MS鉴定结果

3 结论

3．1 采用风味酶酶解小麦面筋蛋白，蛋白利用率高，反应条件温和，无有害物质产生，得到了水解度较高的面筋蛋白水解液。

3．2 将小麦面筋蛋白酶解液与半胱氨酸和木糖共混后加热，制备出了具有肉香风味的美拉德产物。并利用正交试验优化了反应工艺，获得的最佳条件为：15%E－WHP、6% 木糖、1．25% 半胱氨酸，pH7、115℃，反应75 min。

3．3 通过SPME－GC－MS鉴定了美拉德产物中的挥发性物质的组分和相对含量，为利用小麦面筋蛋白水解物制备肉香调味基料提供了理论依据。

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