双酶法水解米糠淀粉的工艺研究

2013-03-19蔡凯凯黄占旺沈柱英孙长涛

中国粮油学报 2013年5期

蔡凯凯黄占旺沈柱英孙长涛

（江西省天然产物与功能食品重点实验室江苏省高等学校天然产物研究与开发重点实验室江西农业大学食品科学与工程学院，南昌 330045）

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）是从日本的传统发酵食品纳豆中发现并分离出来的一种益生菌，其代谢产物纳豆激酶具有十分有效地溶栓效果［1－2］，而其菌体本身、芽孢和其他代谢产物对于宿主也具有很好的肠道菌群调节作用及提高免疫的功效［3－7］。目前，在纳豆芽孢杆菌的高密度液态发酵中，普遍直接使用蔗糖和葡萄糖等作为碳源，导致生产成本相对较高。

米糠是稻谷在碾米过程中产生的副产品，是糙米碾压过程中被碾下的皮层及少量米胚和碎米的混合物。约占稻谷质量的5%～8%［8］。米糠是一种可再生的、廉价的、数量巨大的低值生物质原料，其富含淀粉、纤维素、蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质等各种营养物质［9］，米糠中以淀粉含量最高，约为33%，如能将其全部转化为葡萄糖，则可作为纳豆菌液态发酵碳源的优质原料。另外还有研究显示，经纳豆菌发酵后的米糠提取物及上清液具有很好的抗氧化、抗衰老和调节肠道功能的作用［10－13］。因此，利用米糠作为发酵基质来发酵纳豆菌，不仅可以节省生产成本，还为以后研制纳豆芽孢杆菌－米糠微生态制剂提供一定的技术指标和试验基础。

本研究主要就利用米糠淀粉作为纳豆芽孢杆菌液态发酵的碳源，对米糠淀粉的水解工艺展开试验，通过查阅有关文献［14－19］，选取细菌α－淀粉酶对米糠中的淀粉进行初步水解，再用糖化酶对水解产物进行糖化，并对其工艺进行研究，以获得最佳工艺条件。

1 材料与方法

1．1 材料与设备

1．1．1 试验材料

米糠粉末：江西吉安县；α－淀粉酶：北京索莱宝科技有限公司；糖化酶：广西南宁庞博生物工程有限公司，均为食品添加剂级；其他试剂均为分析纯。

1．1．2 试验仪器

电子万用炉：北京市永光明医疗仪器厂；PHB－5型pH计：杭州雷磁分析仪器厂；AR2140电子分析天平：奥豪斯国际贸易有限责司；SW－600－2S数显三用恒温水箱：金坛市科析仪器有限公司；10L－4B型电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；V－5600型可见分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 米糠基本成分的测定［20］

粗淀粉含量测定采用酸水解法；粗蛋白含量测定采用常量凯氏定氮法（GB 5511—1985）；粗脂肪含量测定采用索氏抽提法（GB 5512—1985）；水分含量测定采用常压干燥恒重法（GB 5497—1985）；总灰分测定采用灼烧重量法（GB 5505—1985）。

1．2．2 测定指标

米糠水解液中还原糖的测定采用斐林试剂法［21］，淀粉水解程度用DE值来表示。

DE值＝料液中还原糖含量／料液中淀粉含量×100%。

淀粉转化率＝DE值／1．11。

1．2．3 工艺路线

米糠50 g→加水调整料液比为1∶5→100℃水浴糊化1 h→加α－淀粉酶液化30 min→煮沸5 min灭酶→加水调整料液比为1∶5→调整pH→加糖化酶糖化→煮沸5 min灭酶→调整至初始质量→DE值的测定

1．2．4 液化单因素试验［17，19，22］

加酶量对液化效果的影响：称取米糠粉末10 g，加50 mL水搅拌均匀，自然pH（6．0），置于水浴锅中100℃糊化60 min，取出冷却至50℃后，以米糠为底物，选取0、4、8、12、16、20 u／g 6个加酶量水平，加入CaCl20．3%，70℃水浴锅中液化30 min，接着煮沸灭酶5 min，冷却补水至初重，测定还原糖含量。

温度对液化效果的影响：称取米糠粉末10 g，加50 mL水搅拌均匀，自然 pH（6．0），置于水浴锅中100℃糊化60 min，取出冷却至50℃后，加酶12 u／g，加入 CaCl20．3%，选取 50、60、70、80、90℃5个水平的温度进行液化30 min，取出后煮沸5 min，冷却补水至初重，测定还原糖含量。

CaCl2添加量对液化效果的影响：称取米糠粉末10 g，加50 mL水搅拌均匀，自然 pH（6．0），置于水浴锅中100℃糊化60 min，冷却至50℃后选取0%、0．1%、0．2%、0．3%、0．4%、0．5%6个梯度的 CaCl2添加量，加酶 12 u／g，70℃反应 30 min，灭酶，测定还原糖含量。

1．2．5 液化正交试验

根据单因素试验的结果，进一步设计L9（34）正交试验，以确定最佳液化条件。液化正交试验因素水平见表1。

表1 液化正交设计表

1．2．6 糖化单因素试验［18－19，23］

加酶量对糖化效果的影响：将在最优液化条件下米糠液化液用糖化酶进行糖化试验，称取液化米糠30 g，搅拌均匀，调节至 pH 4．5，温度60℃，加酶量梯度为 50、100、150、200、250、300 u／g，酶解 120 min，测定还原糖含量。

温度对糖化效果的影响：称取液化米糠30 g，搅拌均匀，调节至 pH 4．5，以 40、50、60、70、80℃为温度梯度，在加酶量为200 u／g的条件下酶解120 min，测定还原糖含量。

pH值对糖化效果的影响：称取液化米糠30 g，搅拌均匀，选取 pH 3．5、4．0、4．5、5．0、5．5作为梯度，60℃下加酶200 u／g，酶解120 min，测定还原糖含量。

糖化时间对糖化效果的影响：称取液化米糠30 g，搅拌均匀，在 pH 4．5，温度 60℃，加酶量 200 u／g条件下分别酶解 0．5、1、2、4、6、8 h，测定还原糖含量。

1．2．7 糖化正交试验

根据单因素试验的结果，进一步设计L16（45）正交试验，以确定最佳糖化条件。糖化正交试验因素水平见表2。

表2 糖化正交设计表

1．2．8 数据处理

单因素采用Excel处理，正交试验采用DPS数据处理软件进行分析。

2 结果与分析

2．1 米糠基本成分

米糠基本成分分析见表3。

表3 米糠基本成分

不同品种的稻谷和不同的碾米工艺制成的米糠，其含有的成分也会有很大差异，赵鑫等［9］就不同品种米糠的营养成分含量做过相关性分析，结果表明不同品种的米糠，水分、蛋白质和灰分含量的差异相对较小，而脂肪含量的差异则十分显著，从10%到24%不等。

2．2 单因素及正交试验

2．2．1 液化单因素试验

2．2．1．1 加酶量对液化 DE值的影响

液化加酶量单因素的结果见图1，可以看出，加酶量对液化有较大影响，在加酶量较少的时候，酶浓度较低，因此反应比较慢，随着加酶量的增加，酶促反应会逐渐加快，DE值升高；当加酶量大于16 u／g时，虽然加酶量充足，但底物浓度却相对降低了，因此DE值的增大不显著。综合考虑，选取8、12、16 u／g 3个加酶量水平作为正交试验的水平。最适加酶量为 16 u／g。

图1 加酶量对液化DE值的影响

2．2．1．2 温度对液化 DE值的影响

液化温度单因素的结果见图2，酶解反应温度在50～60℃时，DE值呈增大趋势；当温度大于60℃时，DE值呈减少趋势。一方面是因为α－淀粉酶作用于淀粉时是从淀粉分子的内部任意切开α－1，4糖苷键，使淀粉分子降解。随着温度的升高，淀粉分子的运动加强，酶与淀粉分子内部的α－1，4糖苷键接触几率增加，受降解的α－1，4糖苷键增加，使DE值增大。另一方面，一开始反应温度升高，逐渐接近酶的最适温度，因此DE值也升高。但超过60℃之后，虽然淀粉分子运动进一步加快，但由于过了淀粉酶的最适温度，所以DE值反而逐渐降低。因此，选取50、60、70℃3个温度水平作为正交试验的水平。最适温度为60℃。

图2 温度对液化DE值的影响

2．2．1．3 CaCl2添加量对液化 DE值的影响

CaCl2添加量单因素的结果见图3，作为α－淀粉酶的保护剂和激活剂，钙离子浓度增加，液化DE值也随之增加，但增加的幅度不大。考虑到生产成本等因素，CaCl2最适添加量为0．2%～0．4%，因此选取0．2%、0．3%、0．4%3个水平作为正交试验的水平。

图3 CaCl2添加量对液化DE值的影响

2．2．2 液化正交试验

为了确定在多因素条件下米糠淀粉液化的最佳条件并了解各因素对液化影响的差异大小，在单因素试验的基础上，以DE值为评定指标，对加酶量、温度、CaCl2添加量3个因素做L9（34）正交试验。液化正交试验的结果分析见表4～表6。

表4 液化正交试验结果直观分析

表5 液化正交试验结果方差分析

从表4液化正交试验结果直观分析表可知，影响液化DE值各因素主次关系为：加酶量＞温度＞CaCl2添加量，得出米糠淀粉液化的最佳工艺参数为A3B2C1，即加酶量为16 u／g，温度为60℃，CaCl2添加量0．2%。在理论最佳工艺基础上进行了验证性试验，得到DE值为24．31%。

从表5方差分析表可知，加酶量和温度对米糠淀粉液化度的影响极显著，CaCl2添加量对米糠淀粉液化度的影响不显著。在酶水解过程中，酶的添加量和底物浓度是决定酶促反应速度的物质基础，所以加酶量对于试验结果的影响最显著。适宜的反应条件是酶高效反应的重要前提，温度过高过低，都会抑制酶的活性，因此温度对试验结果的影响也很显著。Ca离子在反应过程中虽然起到了保护剂和促进剂的作用，但对于整体的酶促反应影响并不是特别重要，因此结果显示并不显著。至于pH，因为糊化后的米糠约pH 6．0，接近淀粉酶的最适pH，而且糊化米糠很粘稠，难以调整pH，因此未进行优化。

在方差分析的基础上进一步对A因素和B因素进行多重比较，由表6可知，在0．05水平下，A因素的3个水平和B因素的3个水平之间差异都是显著的，在0．01水平下，A因素的3个水平之间差异依然是显著的，而B因素的水平2和水平1之间差异不显著，水平1和水平3之间差异显著。

表6 液化正交结果多重比较表（Duncans新复极差法）

2．2．3 糖化单因素试验

2．2．3．1 加酶量对糖化 DE值的影响

图4 加酶量对糖化DE值的影响

糖化加酶量单因素结果见图4，DE值随着加酶量的增加而增大，当加酶量超过200 u／g时，随着酶用量的增加，底物浓度降低，反应效率降低，DE值增大不多。考虑到生产成本因素，糖化酶的最适添加量为200 u／g，并选取50、100、150、200 u／g 4个水平作为正交试验的水平。

2．2．3．2 温度对糖化 DE值的影响

糖化温度单因素试验结果见图5，60℃之前，糖化DE值随着温度的升高而增加，因为温度逐渐接近酶的最适温度，在60℃左右达到最大值。超过60℃之后，温度过高，超过了酶的最适温度，酶的活性反而被抑制了，DE值也随之降低。并且随着温度上升，葡萄糖分子中的羰基和水解液中的一些氨基发生美拉德反应［23］，都会在一定程度上影响DE值。所以，糖化酶的最适温度为60℃。综合考虑，选取50、60、70、80℃4个温度水平作为正交试验的水平。

图5 温度对糖化DE值的影响

2．2．3．3 pH对糖化 DE值的影响

糖化pH单因素结果见图6，当酶解反应为的pH 3～4．5时，DE值逐渐升高；当酶解反应为pH 4．5～6时，DE值逐渐降低。由于pH的变化会引起酶的活性中心或酶分子出现构象上的变化，影响其与底物的结合能力和催化能力［24］，所以影响酶的活性。因此，选取 pH 4．5作为最适 pH，并选取 4．0、4．5、5．0、5．5 4个水平作为正交试验的水平。

图6 pH对糖化DE值的影响

2．2．3．4 时间对糖化 DE值的影响

糖化时间单因素结果见图7，反应时间在6 h之前，随着反应时间的延长，DE值迅速增大；6 h后，DE值有所增加但变化不大。由于酶反应具有高效性和高度专一性，在适当的温度下和pH时，反应速率迅速提高，但反应到一定时间后，底物浓度会相对降低，所以酶解反应也会减速，使得DE值增加不显著。因此，考虑到生产效率等因素，选取6 h作为最佳糖化时间，并选取2、4、5、6 h 4个水平作为正交试验的水平。

图7 时间对DE值的影响

2．2．4 糖化正交试验

为了确定在多因素条件下米糠淀粉糖化的最佳条件并了解各因素对糖化影响的差异大小，在单因素试验的基础上，以DE值为评定指标，对加酶量、温度、pH、时间4个因素做L16（45）正交试验。糖化正交试验的结果分析见表7～表9。

表7 糖化正交试验结果直观分析

表8 糖化正交试验结果方差分析

由表7糖化正交试验结果直观分析表可知，影响糖化度各因素的主次关系为：温度＞加酶量＞时间＞pH，得出米糠淀粉糖化的最佳工艺参数为A4B2C1D4，即加酶量为 200 u／g，温度为 60℃，pH 4．0，时间为6 h。在最佳理论工艺基础上进行了验证性试验，得到DE值为98．96%。

从表8方差分析表可以看出，糖化温度对米糠淀粉糖化度影响极显著，糖化加酶量对米糠淀粉糖化度影响显著；糖化时间和pH对米糠淀粉糖化度影响不显著。由于糖化酶专一性相比而言比较低，糖化过程中伴随着复杂的糖苷键的水解和结合，因此糖化过程需要稳定的反应温度，所以温度的影响最大，其次才是加酶量，pH和时间影响则较小。这与刘建党等［18］的试验结果相吻合。

在方差分析的基础上进一步对A因素和B因素进行多重比较，由表9可知，在0．05水平下，A因素第4水平和第3水平，第3水平和第2水平之间差异不显著，第2水平和第1水平之间差异显著，B因素和A因素差异显著情况相同；在0．01水平下，A因素水平4和3、3和2、2和1之间的差异均不显著，B因素水平2和1、1和3之间差异不显著，水平3和4之间差异显著。

表9 糖化正交结果多重比较表（Duncans新复极差法）

3 讨论与结论

双酶法提取米糠淀粉，以水解DE值为指标，试验结果表明：

米糠淀粉液化过程，在单因素基础上通过正交优化得出米糠淀粉液化最佳工艺为：加酶量为16 u／g，温度为60℃，CaCl2添加量0．2%；DE值为24．31%。其中，加酶量和温度对米糠淀粉液化度影响极显著，CaCl2添加量对米糠淀粉液化度影响不显著。

米糠淀粉糖化过程，在单因素基础上通过正交优化得出糖化最佳工艺为：加酶量为200 u／g，温度为60℃，pH 4．0，时间为 6 h；DE值为 98．96%。其中，糖化温度对米糠淀粉糖化度影响极显著，糖化加酶量对米糠淀粉糖化度影响显著；糖化时间和pH对米糠淀粉糖化度影响不显著。

本试验采用淀粉酶和糖化酶两种酶对米糠淀粉进行水解工艺研究，米糠粗淀粉的转化率达到了89%，通过查阅一些文献发现，目前使用酶法提取淀粉，其产物得率有较大差异，原因是原料性质不同，淀粉结构及存在形式也有较大差异［18，25－26］，使得酶作用的效果不一，影响了结果。米糠中含有大量的纤维素等物质，一定程度上影响了淀粉的水解和转化，因此，提高米糠淀粉的转化率水解工艺还有待进一步深入研究。

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