雨蛙素腹腔注射致小鼠慢性胰腺纤维化病理组织学观察

崔立华，张 一，白景瑞，李东华，刘洪斌

实验研究

雨蛙素腹腔注射致小鼠慢性胰腺纤维化病理组织学观察

崔立华，张 一，白景瑞，李东华，刘洪斌

目的：采用雨蛙素反复腹腔注射诱导小鼠慢性胰腺炎，评估胰腺发生纤维化的程度及病变特点。方法：健康雄性C57BL/6小鼠20只，随机分为两组，模型组反复腹腔注射雨蛙素，对照组腹腔注射与模型组等体积的生理盐水，于第7周第1 d留取胰腺组织，光镜下进行胰腺腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润、间质纤维组织增生评分；另一部分行苦味酸-天狼星红染色，偏振光显微镜下观察胰腺间质胶原增生情况；第三部分行免疫组织化学染色，观察α-SMA表达情况。结果：模型组小鼠胰腺HE染色显示明显腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润及纤维化；苦味酸-天狼星红染色显示显著胰腺间质胶原增生，评分明显升高；免疫组织化学染色显示星状细胞活化标志物α-SMA表达明显增强。结论：雨蛙素反复多次腹腔注射可诱导小鼠产生明显的胰腺纤维化病变，纤维化发生机制可能与胰腺星状细胞活化分泌过多细胞外间质有关。

雨蛙素；慢性胰腺炎；纤维化；胰腺星状细胞；小鼠

慢性胰腺炎典型病理表现是胰腺纤维化，本质是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成增多、降解相对减少导致的ECM沉积[1-2]。胰腺星状细胞活化转化为肌成纤维细胞合成大量胶原纤维，是导致胰腺纤维化的关键步骤，α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达是胰腺星状细胞活化的主要标志[3-4]。雨蛙素是一种胆囊收缩素类似物,可刺激胰腺外分泌部，使胰蛋白水解酶分泌大量增加，从而引起胰腺腺泡的自溶。原主要用于建立急性水肿型胰腺炎动物模型[5-6]，近年来发现，其多次注射可造成胰腺慢性炎症[7]。因此本文采用大剂量雨蛙素反复腹腔注射诱导小鼠慢性胰腺炎,评估胰腺发生纤维化的程度及病变特点。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性C57BL/6小鼠，体质量19～22 g，购自中国医学科学院放射医学研究所。

1.2 主要试剂与仪器 雨蛙素为Sigma产品，以无菌生理盐水配成1 mg/mL，置冰箱保存。用时以无菌生理盐水稀释成所需浓度。天狼星红购自Fluka公司。山羊抗小鼠α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体购自Santa Cruz公司。DM4000B型研究级显微镜、RM 2235型轮转式切片机、ASP300型全自动组织脱水机均为德国Leica公司产品，BX53型偏振光显微镜为日本OLYMPUS公司产品。

1.3 模型制作及分组 雨蛙素注射方法参考有关文献并加以改进[8]。健康雄性C57BL/6小鼠20只，随机分为两组。模型组每周一、三、五连续6周腹腔注射雨蛙素，6次/d，注射间隔为1 h，剂量每次50 μg/kg。对照组腹腔注射与模型组等体积的生理盐水，注射方案与模型组相同。

1.4 标本留取方法 将动物于第7周第1 d腹腔注射麻醉，留取胰腺组织，福尔马林固定。一部分行HE染色，观察胰腺腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润、间质纤维组织增生情况；另一部分行苦味酸-天狼星红染色，偏振光显微镜下观察胰腺间质胶原增生情况；第三部分行免疫组织化学染色，观察α-SMA表达情况。

1.5 HE普通病理组织学观察及评分 取一部分胰腺组织10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，5 μm切片，行HE染色，光镜下观察。按有关文献评分标准进行胰腺腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润及纤维化程度评分[9]。

1.6 苦味酸-天狼星红染色观察胰腺间质胶原增生情况 采用饱和苦味酸-天狼星红染色法。切片脱蜡水化，蒸馏水洗3次，入饱和苦味酸-天狼星红液染15 min，流水冲洗浮色，无水乙醇分化，镜下控制染色，苏木素复染细胞核。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下胶原纤维呈红色，细胞核呈蓝色，观察胰腺组织中胶原沉积部位。偏振光显微镜观察纤维化区域胶原成分。每张饱和苦味酸-天狼星红胶原染色切片，在100倍光镜下任选10个视野，拍照后运用Leica Image Analysis软件，采用累积光密度值(IOD)作为参数对胰腺组织中胶原纤维表达进行半定量分析。

1.7 免疫组织化学染色观察α-SMA表达情况 胰腺组织切片常规脱蜡至水，加入1∶100稀释兔抗小鼠α-SMA一抗，4℃过夜（PBS代替一抗作阴性对照），然后加入羊抗兔IgG-HRP作用30 min。DAB显色,苏木精复染。以细胞浆内出现黄、棕色颗粒为阳性细胞。细胞的着色强度可分为以下级数：(-)为细胞无着色；(+)为细胞浆淡棕黄色；(++)为中度棕黄色；(+++)为深度棕黄色。用Leica Image Analysis软件，对各组切片单位面积阳性细胞数进行定量分析，每张切片任取10个视野取其平均值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差()表示，均数之间的差异采用t检验，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 病理组织学观察及评分 对照组胰腺组织小叶结构基本正常；模型组胰腺组织中小叶腺泡萎缩、消失，小叶间质明显纤维组织增生，大量炎性细胞浸润（见图1）；与对照组比，模型组腺泡萎缩、炎细胞浸润及纤维化程度评分均显著升高（见表1）。

图1 胰腺组织HE染色（200×）

表1 两组小鼠模型胰腺病理组织学评分比较()

表1 两组小鼠模型胰腺病理组织学评分比较()

注：与对照组比较，aP＜0.01

组别对照组模型组n 10 10腺泡萎缩0 2.54±0.42a炎细胞浸润0 3.47±0.33a纤维化程度0 3.26±0.41a

2.2 饱和苦味酸天狼星红胶原染色观察胰腺间质胶原增生情况 应用图像分析软件对苦味酸-天狼星红胶原染色图片进行分析，结果显示，雨蛙素反复腹腔注射6周模型组小鼠胰腺组织中胶原纤维含量较对照组明显增多，见表2，且以黄、橙、红色的粗纤维状Ⅰ型胶原纤维为主，而细长的绿色Ⅲ型胶原纤维较少，见图2。

2.3 胰腺组织内α-SMA表达情况 对照组胰腺组织α-SMA阳性染色细胞稀少，偶见于胰管壁，而模型组胰腺组织α-SMA阳性染色细胞显著增多，广泛分布于腺泡周围及小叶间质，见图3。单位面积阳性细胞数进行定量分析显示模型组显著高于对照组，见表3。

表2 两组小鼠胰腺组织胶原表达情况()

表2 两组小鼠胰腺组织胶原表达情况()

注：与对照组比较，aP＜0.01

组别对照组模型组n 10 10累积光密度0.86±0.67 21.25±3.24a

图2 胰腺组织饱和苦味酸-天狼星红染色

图3 胰腺组织α-SMA免疫组化染色

表3 两组小鼠胰腺星状细胞活化状态()

表3 两组小鼠胰腺星状细胞活化状态()

注：与对照组比较，aP＜0.01

组别对照组模型组n 10 10单位面积a-SMA阳性细胞数0.15±0.005 12.23±2.13a

3 讨论

慢性胰腺炎是由不同因素造成胰腺组织和功能持续性损害，最终导致胰腺内外分泌功能的永久性丧失，胰腺纤维化是其典型病理表现之一。胰腺纤维化主要表现为组织中的细胞外基质组成和数量上的病理性改变，直接源于ECM合成和降解的失衡。文献报道，胰腺纤维化时主要的基质成分包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原以及纤维连接蛋白和层黏蛋白[10]。本研究显示，雨蛙素反复腹腔注射6周，模型组小鼠产生了明显的胰腺慢性炎症及纤维化病变。胶原纤维主要分布于胰导管、血管及萎缩变性的腺泡细胞旁，破坏的腺泡、小叶间的胰腺间质呈广泛的纤维化，偏振光显微镜显示胶原成分主要以Ⅰ型胶原为主，Ⅲ型胶原次之。应用计算机图像分析系统对胶原表达量进行定量分析，结果显示，模型组小鼠胰腺胶原表达量较对照组显著增高,证实雨蛙素反复腹腔注射可以导致小鼠胰腺的明显纤维化。

苦味酸-天狼星红是一种作用很强的酸性染料，可与胶原分子牢固结合，吸附稳定，不易褪色[11]。天狼星红染料分子呈长形展开，在长轴方向以彼此平行的方式附着于每个胶原分子，胶原的双折射性明显增强，因而入射的正交偏光由于双折射而发生的光干涉明显，不同折射率表现出不同的干涉色和折射强度。Ⅰ型胶原纤维由多个原纤维粒合成，成熟、粗大，折射率强，故偏光镜下呈亮黄、橙或红色粗纤维状。Ⅲ型胶原纤维以原纤维形式存在，纤细、幼稚，折射率弱，故偏光下为细长的绿色纤维。因此，苦味酸-天狼星红胶原染色法操作简便、胶原形态和分布显示清晰，结果稳定可长期保存，同一切片中Ⅰ/Ⅲ型胶原颜色对比鲜明。

苦味酸-天狼星红染液可使胶原纤维特异性地染成猩红色，非胶原纤维部分不见猩红色背景，这样的染色结果使得胶原纤维的图像识别效果良好，能进行定量研究，是显示胶原和研究纤维性病变的较好方法。而Masson三色染色法、VG染色等特殊染色虽能表达胶原总体的变化，但不能同时区分Ⅰ、Ⅲ型胶原，且易褪色，不易长久保存。免疫组化染色虽能区分Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，但不能在同一切片中同时反映两种胶原(Ⅰ/Ⅲ型)的变化，不利于综合分析，且操作繁琐。本文采用的苦味酸天狼星红-偏振光法，是一种操作简便、经济、效果鲜明的胶原显示法。

胰腺星状细胞在慢性胰腺纤维化形成中起重要作用[12]。胰腺损伤后，胰腺星状细胞被激活并处于持续激活状态，继而转化为肌成纤维细胞，合成并分泌ECM，最终可导致胰腺纤维化。多项研究表明，胰腺纤维化的本质是胶原为主的ECM合成增多，降解减少，导致过多的ECM沉积。活化的胰腺星状细胞是受损胰腺中合成ECM，导致纤维化发生的主要效应细胞。胰腺星状细胞的增生和活化是胰腺纤维化发生的中心环节，各种致纤维化因素共同通过胰腺星状细胞这一靶细胞途径，合成大量的ECM沉积在胰腺，从而导致胰腺纤维化的发生。本研究中，对照组胰腺组织α-SMA染色稀少,而模型组胰腺组织α-SMA阳性染色细胞显著增多，广泛分布于腺泡周围及小叶间质，通过单位面积阳性细胞数进行定量分析显示模型组显著高于对照组，可见胰腺星状细胞显著激活。

雨蛙素反复多次腹腔注射可诱导小鼠产生明显的胰腺慢性炎症及纤维化病变，是一种较为理想的慢性胰腺炎模型。胰腺星状细胞活化在纤维化过程中有重要作用。苦味酸天狼星红偏振光法是一种有效的研究纤维化的胶原显示法。

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（收稿：2013-04-06 修回：2013-07-20）

（责任编辑 王 丰）

Pancreatic Fibrosis in Mice Induced by Intraperitoneal Injection of Cerulein

CUI Li-hua,ZHANG Yi,BAI Jing-rui,et al. Department of Pharmacology,Tianjin Acute Abdominal Diseases Institute,Tianjin(300100), China

Objective To observe the pathological characteristics of the fibrosis in the mouse model of chronic pancreatitis(CP).MethodsTwenty male C57BL/6 mice were divided into two groups（10 animals per group).The model mice received repeated intraperitoneal injection of cerulein.The control group mice received saline injections.Seven weeks after the first intraperitoneal injection the pancreas was removed for pathological assessment of acinar atrophy,inflammatory infiltration and fibrosis.The second part was stained with picric-siri⁃us red and observed by polarized light microscopy.The third part of pancreatic specimen was used to examine α-smooth muscle actin(α-SMA)expression by immunohistochemical method.ResultsAll mice that received cerulein injections displayed histopathological signs of chronic pancreatitis with significant acinar atrophy,in⁃flammatory infiltration and fibrosis.Picric-sirius red staining suggested a significant increase of collagen in the pancreas of the model mice.In addition,the α-SMA expression in pancreas was increased markedly in model mice compared with the control group mice.ConclusionRepeated intraperitoneal injection of cerulein could induce significant chronic pancreatic fibrosis.The pathogenesis was associated with increased number of activat⁃ed pancreatic stellate cells and their secreted extracellular matrix.

Cerulein;chronic pancreatitis;fibrosis;pancreatic stellate cell;mice

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2013)05-0518-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.011

天津市中西医结合急腹症研究所药理学研究室（天津 300100）

刘洪斌，E-mail：jtss@sina.com