耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

张慧敏， 李剑芳， 邬敏辰， 魏喜换， 杨严俊

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 医药学院，江苏 无锡 214122）

β-1，4-内切木聚糖酶 （endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8），能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。根据催化结构域氨基酸的同源性和疏水簇分析法可将木聚糖酶划分为糖苷水解酶10家族和11家族[1]。木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织等工业领域都有着重要的应用价值，但由于纸浆漂白、饲料制粒等工艺均需要较高温度，因此耐热木聚糖酶的研究和开发得到了很多研究者的青睐[2]。目前已发现了许多能产11家族耐热木聚糖酶的微生物，如Thermomyces lanuginosus[3]，Paecilomyces varioti[4]，Dictyoglomus thermophilum[5]，Chaetomium thermophilum和Nonomuraea flexuosa[6]等，其中许多耐热木聚糖酶基因已被克隆并表达在合适的宿主中[3，7]。毕赤酵母表达系统由于能高效分泌外源蛋白质到胞外，并能进行高密度发酵，因而在木聚糖酶研究中备受关注[8]。

EvXyn11TS是一种来源于细菌的极端耐热木聚糖酶突变体（GenBank登录号 EU591743），它的热稳定性非常好，在90℃下处理 60 min酶活不下降[9]，具有适合于工业应用的理想特性。为实现EvXyn11TS在工业上的应用。拟将该耐热基因在毕赤酵母 （Pichia pastoris）GS115中的进行分泌表达，但是由于它来源于细菌，其密码子偏好性与毕赤酵母有较大差异，于是对此耐热基因中的稀有密码子进行优化，并命名为Syxyn11。采用人工方法合成Syxyn11基因，后通过分子生物学手段获得重组毕赤酵母基因工程菌，对重组木聚糖酶进行酶学性质研究，为耐热木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和培养基

E.coli DH5α、P.pastoris GS115 和 表 达 质 粒pPIC9K:由作者所在实验室保藏；pUCm-T质粒:购自上海 Sangon公司；LB、YPD、MD、BMGY 和 BMMY培养基:参见Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手册。

1.2 主要试剂

rTaq酶、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、250 bp DNA Ladder Marker和低相对分子质量蛋白质 Marker:购于大连 TaKaRa公司；Tryptone、Yeast Extract、YNB、G418 和 EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit:购自上海Sangon公司；标准木糖、榉木木聚糖:购于Sigma公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 重组质粒pUCm-T-Syxyn11的构建

根据密码子的偏爱性，宿主细胞能够以不同的速度合成蛋白质。编码蛋白质的基因中有些密码子对应的tRNA含量少（即属于稀有密码子），所以合成量较少，宿主以此来控制蛋白质的合成速度。因此按照密码子的偏好性，对外源蛋白质编码基因进行密码子优化可以有效提高外源蛋白质的表达量[10]。为实现来源于细菌的耐热木聚糖酶基因Evxyn11TS在P.pastoris中的高表达，对Evxyn11TS成熟肽基因序列（585 bp）进行分析，发现其密码子的偏好性与毕赤酵母有很大差异。遂对照毕赤酵母密码子偏好性表对Evxyn11TS中的稀有密码子进行优化，并在基因两端分别加入EcoRⅠ、NotⅠ位点，该基因命名为Syxyn11，合成后克隆至pUCm-T质粒，获得重组质粒pUCm-T-Syxyn11，并对其进行测序，测序结果与预期相符。

1.4 重组表达质粒的构建

将重组质粒pUCm-T-Syxyn11进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，割胶回收约600 bp的目的基因Syxyn11，与经同样双酶切的质粒pPIC9K连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，经通用引物（5’-AOX和3’-AOX）PCR筛选鉴定后，测序正确的重组质粒命名为pPIC9K-Syxyn11。

1.5 Syxyn11在P.pastoris中的表达

pPIC9K-Syxyn11经SalⅠ线性化后，用电穿孔法将其导入P.pastoris GS115中，涂布于MD平板上筛选重组毕赤酵母；将在MD平板上生长良好的菌落用牙签点种至含不同质量浓度G418的YPD平板上筛选抗高质量浓度G418（2.0 mg/mL）的重组毕赤酵母，命名为GS115/Syxyn11；同时电转pPIC9K至P.pastoris GS115做对照，并命名为GS115/9K。参照《分子克隆实验指南》中的方法[11]提取重组子的基因组DNA。以此为模板，利用通用引物5′-AOX和3′-AOX进行PCR验证。耐热木聚糖酶基因Syxyn11的常规诱导表达参见Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen 公司）操作手册。

1.6 木聚糖酶的活性测定及分析

木聚糖酶酶活测定采用改良的DNS试剂法[12]，用榉木木聚糖作为底物，其中酶反应温度设定为65℃，以在测定的条件下，每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U）。蛋白质质量分数测定采用考马斯亮蓝染色法 （Bradford法），以牛血清白蛋白为标准。并采用SDS-PAGE对表达产物进行分析及表观相对分子质量的测定。

1.7 重组木聚糖酶酶学性质分析

1.7.1 酶的最适反应温度及热稳定性 取适当稀释酶液于55～95℃水浴条件下进行酶解反应，每隔5℃测定酶活，以酶活力最高者为100%，作温度—相对酶活性曲线；将酶液于不同温度下保温不同时间后，按常规方法测定残余酶活性，以0 min时取出的酶液的酶活性为100%，作温度——相对酶活性曲线。当残余酶活达到85%以上，即定义为稳定。

1.7.2 酶的最适pH及pH稳定性 65℃下，分别测定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性。以酶活力最高者为100%，作pH—相对酶活性曲线；将酶在不同的pH值条件下于40℃保温1 h，再分别测定残留酶活性，以酶活力最高者为100%，作pH—相对酶活性曲线。当残余酶活达到85%以上，即定义为稳定。反应所用的缓冲液为:0.1 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 （pH 3.5～8.0）和0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化纳缓冲液（pH 8.5～9.5）。

1.7.3 金属离子对酶活性的影响 将不同金属离子溶液与酶液混合，至终浓度为2 mmol/L，40℃保温1 h，然后按常规方法测定残余酶活性，以不加金属离子的酶活性定义为100%，残余酶活与其的比值为相对酶活。

2 结果与讨论

2.1 表达质粒pPIC9K-Syxyn11的构建

通过密码子优化后获得重组质粒pUCm-TSyxyn11，将其用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，1.0 g/dL琼脂糖凝胶电泳分离。如图1所示，在约2.7 kb和0.6 kb处可见特异性DNA条带，分别为线性化的pUCm-T和目的基因Syxyn11。将Syxyn11与经同样双酶切的质粒pPIC9K连接，转化DH5α。经通用引物鉴定后，筛选得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11，测序结果与预期相符，并将该优化序列提交至GenBank核酸数据库，登陆号为JX459567。

图1 pUCm-T-Syxyn11的EcoRⅠ和NotⅠ双酶切电泳图Fig.1 Double digestion of pUCm-T-Syxyn11 by EcoRⅠand NotⅠ

2.2 毕赤酵母重组子的鉴定

以高拷贝重组毕氏酵母GS115/Syxyn11基因组为模板，进行PCR扩增鉴定，PCR产物经1.0 g/dL琼脂糖凝胶电泳分析，见图2。GS115/Syxyn11的PCR产物在1.1 kb和2.1 kb处可见两条清晰的条带（图2泳道2～3），而对照组GS115/9K PCR产物的两条条带大小分别为0.49 kb和2.1 kb（图2泳道1），表明Syxyn11已整合入GS115/Syxyn11基因组内。

图2 毕赤酵母重组子基因组PCR验证Fig.2 Verification of P.pastoris transformants by PCR

2.3 重组蛋白的表达和鉴定

挑选GS115/Syxyn11菌落和GS115/9K菌落进行常规诱导表达96 h，8 000 r/min离心10 min后收集上清液，取上清液用改良的DNS法测定木聚糖酶活性。结果表明，GS115/Syxyn11发酵液上清液木聚糖酶酶活可达到17.74 U/mL，而GS115/9K并未检测到木聚糖酶活性。SDS-PAGE结果见图3。GS115/Syxyn11的表达产物在相对分子质量31 000处有明显的目的蛋白SyXyn11条带（图3泳道2），而对照GS115/9K在该处无条带（图3泳道1）。SyXyn11相对分子质量比前期测出的相对分子质量 （21 000）大，分析其原因可能是由于SyXyn11氨基酸序列中含有3个N-糖基化位点及在C末端的两个O-糖基化位点。

图3 表达产物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.4 重组木聚糖酶酶学性质

2.4.1 酶的最适反应温度及热稳定性 由图4可以看出，在80～90℃范围内，SyXyn11酶活力较高，相对酶活可达85%以上，其中最适反应温度为85℃；从热稳定性曲线可看出，SyXyn11在80℃以下较稳定，如在80℃保存60 min后，酶活仅损失14.1%。说明该酶的热稳定性好，在高温下可长时间保持稳定。

图4 温度对SyXyn11酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity of the SyXyn11

2.4.2 酶的最适pH及pH稳定性 在不同pH值下进行酶活性检测，结果见图5。该酶的最适反应pH为6.5，当pH＜5.5或者pH＞7.5时，酶活力下降较快；该重组酶在pH 5.0～7.5范围内稳定，当pH值低于5.0或高于7.5时，该酶的稳定性较差，如酶液分别在pH 4.5和pH 8.0下保存1 h，酶活分别损失40%、30%。

图5 pH对SyXyn11酶活力的影响Fig.5 Effect of pH on the activity of the SyXyn11

2.4.3 金属离子对酶活性的影响 如图6所示，EDTA和大多数供试金属离子对重组酶的活性影响不大，这说明该酶对大部分金属离子都具有抗性，能够应用于不同的工业加工过程，具有重要的应用价值。

图6 金属离子和EDTA对SyXyn11酶活力的影响Fig.6 Effects of various metal ions and EDTA on the activity of the SyXyn11

3 结语

由于耐热木聚糖酶具有重要的工业应用价值，通过基因工程实现耐热木聚糖酶的异源高效表达是降低其工业应用成本、适应工业应用条件的有效手段。目前，已经有许多耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中实现了分泌表达。Ghaffar等克隆了来自于C.thermophilum的耐热木聚糖酶基因xyn11A，并在P.pastoris GS115中进行了表达，其最高酶活可达到15.6 U/mL[7]。

作者成功实现了11家族耐热木聚糖酶基因Syxyn11在P.pastoris GS115中的分泌表达，通过甲醇诱导发酵，酶活可高达17.74 U/mL。通过SDS-PAGE鉴定出重组木聚糖酶SyXyn11的相对分子质量在31 000左右。酶学性质研究表明，该重组酶的最适反应温度为85℃，80℃以下稳定；最适反应pH 6.5，并在pH 5.0～7.5时稳定；EDTA和大多数供试金属离子对重组酶的活性影响不大。据文献报道的最耐热木聚糖酶是N.flexuosa所产的Xyn11A，其最适温度为80℃[6]，而SyXyn11比以往报道的任何11家族木聚糖酶具有更高的耐热性，使得该酶在许多工业领域中可能具有一定的应用潜力和优势。然而该酶在P.pastoris中的表达量并不高，因此如何提高它的表达量将是下一步研究的重点。

[1]Polizeli M L T M，Rizzatti A C S，Monti R，et al.Xylanases from fungi:properties and industrial applications[J].Appl Microbiol Biotechnol，2005，67:577-591.

[2]Collins T，Gerday C，Feller G.Xylanases，xylanase families and extremophilic xylanases[J].FEMS Microbiol Rev，2005，29:3-23.

[3]Damaso M C T，Almeida M S，Kurtenbach E，et al.Optimized expression of a thermostable xylanase from Thermomyces lanuginosus in Pichia pastoris[J].Appl Environ Microbiol，2003，69:6064-6072.

[4]Kumar P R，Eswaramoorthy S，Vithayathil P J，et al.The tertiary structure at 1.59 A˚resolution and the proposed amino acid sequence of a family-11 xylanase from the thermophilic fungus Paecilomyces varioti bainier[J].J Mol Biol，2000，295:581-593.

[5]McCarthy A A，Morris D D，Bergquist P L，et al.Structure of XynB，a highly thermostable beta-1，4-xylanase from Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1，at 1.8 A˚resolution[J].Acta Crystallogr D:Biol Crystallogr，2000，56:1367-1375.

[6]Hakulinen N，Turunen O，Janis J，et al.Three-dimensional structures of thermophilic beta-1，4-xylanases from Chaetomium thermophilum and Nonomuraea flexuosa[J].Eur J Biochem，2003，270:1399-1412.

[7]Ghaffar A，Khan S A，Mukhtar Z，et al.Heterologous expression of a gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in Pichia pastoris GS115[J].Mol Biol Rep，2011，38:3227-3233.

[8]Zhou C Y，Wang Y T，Wu M C，et al.Heterologous expression of xylanase II from Aspergillus usamii in Pichia pastoris[J].Food Technol Biotechnol，2009，47:90-95.

[9]Dumon C，Varvak A，Wall M A，et al.Engineering hyperthermostability into a GH11 xylanase is mediated by subtle changes to protein structure[J].J Biol Chem，2008，283:22557-22564.

[10]金光泽，段作营，张莲芬，等.重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达[J].食品与生物技术学报，2010，29:595-601.JIN Guang-ze，DUAN Zuo-ying，ZHANG Lian-fen，et al.Expression of the fusion protein human serum album/mutant human interleukin 2C125A in Pichia pastoris[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29:595-601.（in Chinese）

[11]Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

[12]Zhou C Y，Bai J Y，Deng S S，et al.Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli[J].Biores Techno，2008，99:831-838.