五味子废渣中多糖的分离及体外抗氧化活性

汪艳群， 孟宪军， 刘 丽， 李 斌， 张 琦， 孙希云

（沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳 110866）

氧化是一个重要的生化过程，正常的细胞功能需要一定浓度的自由基，但过量的自由基会损坏细胞中的脂质、蛋白质和DNA；自由基与许多疾病有关，如癌症、风湿性关节炎、动脉粥样硬化，并导致衰老[1-3]。虽然机体有对抗氧化损伤的防御和修复系统，但却不能彻底阻止氧化损伤[4]。由于人工合成的抗氧化剂，如BHA、BHT、PG、TBHQ等会造成肝损伤并有致癌作用[5]，因此开发天然有效的抗氧化剂变得很有必要。五味子 （Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.），木兰科多年生落叶藤本。五味子可食用也可药用，常作为方剂用于治疗和预防各种疾病，可用于生产药品、保健品、化妆美容品和多种饮品、食品添加剂等。早期对五味子的研究大多集中在其脂溶性成分上，20世纪90年代以来，许多学者从五味子水提液中分离得到了多糖，发现其具有保肝、抗疲劳、增强免疫系统功能、降血糖、降血脂等多种生理功能[6-10]。作者利用提取过五味子脂溶性成分后的残渣提取多糖，不仅可对副产物进行综合利用，并在多糖分离纯化中还可省去脱脂步骤；分离纯化后对多糖抗油脂氧化能力及对羟基自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（·O2-）、DPPH·自由基的清除能力进行了测试，以评价其抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

五味子残渣:实验室提取五味子木脂素后残渣；猪油:市售新鲜猪板油，文火熬制，过滤后备用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH·）:分析纯，Sigma公司；Sephacryl S-300 HR:瑞典 Pharmacia公司；聚酰胺（100～130目）、抗坏血酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、邻二氮菲，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等:均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

7200型可见分光光度计:尤尼柯（上海）有限公司；BSZ-100自动部分收集器:上海沪西分析仪器厂；紫外可见分光光度计:上海分析仪器厂；LC-10A型高效液相色谱仪:日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 干燥后的五味子残渣，过40目筛，以料液比1∶40，90℃水浴浸提5 h，离心后收集上清液，采用酶法与三氯乙酸-正丁醇法结合除蛋白，蛋白酶用量为1%、酶解温度为50℃、酶解时间为140 min、pH值5，酶解后离心得上清液，再用三氯乙酸-正丁醇法处理4次，每次处理均离心去除沉淀，最后将上清液透析，旋转蒸发浓缩，用4倍体积的无水乙醇（乙醇终体积分数为80%）醇析5 h，收集沉淀即为五味子粗多糖。

1.2.2 五味子多糖的纯化 五味子粗多糖用聚酰胺柱层析进行脱色和分离，再经Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析得到均一组分SCP-0。将SCP-0经紫外光谱、Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析法及凝胶渗透色谱法（GPC）进行纯度鉴定。

1.2.3 抗氧化活性研究

1）对羟基自由基（·OH）清除能力的测定:以VC为参照物，试验参考Liu等人[11]的方法，略作调整。取1.5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL，加0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液 （pH 7.4）2.0 mL，充分混匀后，加1.5 mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL，加入样品溶液1.0 mL，每加一管立即混匀，加0.01%H2O2溶液1.0 mL。整个反应体系共6 mL体积。反应在37℃恒温水浴中进行，准确反应1 h后，在536 nm波长处测定吸光度。损伤组（A1）中用1.0 mL去离子水代替样品溶液；未损伤组（A0）中用2.0 mL去离子水代替样品溶液和H2O2溶液。按下式计算样品对·OH的清除率。

式中:AX为样品组吸光度；A0为未损伤组吸光度；A1为损伤组吸光度。

2）对超氧阴离子自由基（·O2-）清除能力的测定:采用改良的邻苯三酚自氧化法[12]，用10 mmol/L盐酸溶解邻苯三酚，制得30 mmol/L的溶液。取50 mmol/mL的Tris-盐酸缓冲溶液 （pH 8.0）2.99 mL于试管中，加入0.01 mL上述邻苯三酚溶液（同时按秒计时），立即搅拌混匀，倒入1 cm光径比色杯中，在325 nm处测吸光度，1 min后开始计数据，每隔30 s记一次，一直记到4 min。按照下式计算邻苯三酚自氧化速率（I0），要求 I0达到 0.07 min-1，若达不到此速率可通过调整邻苯三酚的浓度来达到。空白管以10 mmol/mL盐酸0.01 mL代替邻苯三酚。

式中:A1为第1分钟吸光度；A4为第4 min吸光度。

样品活性测定:样品管代替自氧化管，取50 mmol/mL 的 Tris-盐酸缓冲溶液（pH 8.0）2.98 mL，加入0.01 mL的样品溶液，再加入0.01 mL、30 mmol/mL的邻苯三酚，其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。为消除色素影响，在空白管中加入和样品管等量样品液，邻苯三酚用10 mmol/mL盐酸0.01 mL代替。计算加样后邻苯三酚自氧化速率（IX），算出对·O2-的清除率。试验以VC为参照物。

3）对DPPH自由基（DPPH·）清除能力的测定:参照Lu等人[13]的方法，试验设样品组和2个对照组。在2 mL的DPPH·醇溶液中加入2 mL样品溶液，混匀后避光反应30 min，立即在517 nm波长处测定吸光度AX。对照组A1中用2 mL去离子水代替样品溶液，对照组A2中用2 mL无水乙醇代替2 mL DPPH·醇溶液。按下式计算样品对DPPH·自由基的清除率。试验以VC为参照物。

式中:A1为无样品组吸光度；A2为无DPPH·组吸光度；AX为样品组吸光度。

4）抗猪油氧化能力的测定:参考李颖畅[14]的方法，准确称取一定质量分数（0.25%、0.5%、1%）多糖及0.25%叔丁基对苯二酚（TBHQ），分别加入到50 g猪油中，剧烈搅拌均匀。同时以不加添加物的油脂作空白。将所有样品放置于烘箱中，用烘箱高温诱导猪油发生过氧化反应，在60～70℃下加速氧化。每隔2小时搅拌1次，并交换其在烘箱中的位置。每2天取出，按照GB5538-2005碘量法测定过氧化值（POV），以POV大小表示油脂的氧化进度，进而衡量抗氧化剂的活性。

2 结果与分析

2.1 纯化及纯度鉴定

2.1.1 聚酰胺柱层析 五味子多糖经过聚酰胺柱层析后得到3个组分，依次为SCP-A、SCP-B和SCP-C，见图 1。分别称质量，并与上样量（1 g）比较，得到各组分所占比例见表1。

图1 五味子多糖的聚酰胺柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution curve of SCP on polyamide column

表1 五味子多糖的聚酰胺柱层析结果Table 1 Elution results of Schisandra chinensis polysaccharide on PV

由于SCP-A的质量分数较大，占总量的67.3%，为五味子多糖的主要组成，SCP-B和SCP-C的含量很少，不方便大量收集，所以本试验只收集SCP-A，对其进行后续纯化处理，SCP-B和SCP-C暂不研究。

2.1.2 Sephacryl S-300 HR柱层析 SCP-A经Sephacryl S-300柱层析后分离得到1个洗脱峰，见图2。收集该峰组分，浓缩，自来水流动透析3 d，蒸馏水透析3 d（每3～4小时换一次蒸馏水），冷冻干燥，得白色蓬松粉末，命名为SCP-0，进行纯度鉴定。

图2 SCP-A的Sephacryl S-300 HR柱层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of SCP-A on Sephacryl S-300 HR column

2.1.3 五味子多糖SCP-0的纯度鉴定

1）全波段光谱扫描:由全波段扫描光谱图3可见，SCP-0在260、280 nm处无吸收，表明它不含蛋白质、多肽及核酸。

图3 SCP-0的全波段扫描光谱Fig.3 Full wavelength scanning spectrum of SCP-0

2）Sephacryl S-300 HR凝胶过滤法:由图4可见，SCP-0的Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析的洗脱曲线为单一洗脱峰，且峰形较为对称，结合紫外吸收光谱的结果，判断其可能为均一组分。

图4 SCP-0的Sephacryl S-300 HR凝胶层析洗脱曲线Fig.4 Elution pattern of SCP-0 on Sephacryl S-300 HR

3）凝胶渗透色谱法（GPC）:SCP-0的凝胶色谱检验结果见图5。有两个组分峰，第一个峰为其主要组分，占SCP-0样品的94.1%，该组分峰形陡峭尖锐，对称性好，说明其分子均一性好，纯度高。对于多糖这样的高分子聚合物而言，通常所说的多糖纯品实质上是一定相对分子质量范围内的均一组分；纯度只代表某一相似链长的平均配布，即均一组分所占比例。SCP-0中另一杂峰面积很小，说明SCP-0为纯度较高的多糖，该纯度已可满足活性分析测定的要求，可用于抗氧化活性的测定分析。

图5 五味子多糖SCP-0的GPC色谱图Fig.5 Gel permeation chromatogram of sample SCP-0

2.2 抗氧化活性测定

2.2.1 对羟基自由基（·OH）清除能力的测定 羟自由基可以轻易穿过细胞膜，与碳水化合物、蛋白质、脂质和DNA等细胞内的生物大分子起化学反应，造成组织损伤或细胞死亡[15]。因此，清除羟自由基对生物系统很重要。从图6可以看出，在试验浓度范围内，五味子多糖SCP-0表现出明显的羟自由基清除能力，并且随着质量浓度的增加，自由基清除率提高，表现出明显的剂量依赖性；SCP-0比对照样品VC的羟自由基清除能力强（p<0.05），其IC50为14.5 mg/mL。以上结果说明:五味子多糖SCP-0具有较好的羟自由基清除能力。

图6 五味子多糖SCP-0对羟自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of SCP-0

2.2.2 对超氧阴离子自由基（·O2-）清除能力的测定试验中，超氧阴离子由邻苯三酚自氧化产生，VC为对照品。样品对超氧阴离子的清除作用见图7。从图7可看出，五味子多糖SCP-0对超氧阴离子几乎没有清除作用。这个结果与对蓝莓多糖[12]和地木耳多糖[16]抗氧化活性研究的结果相似。

图7 五味子多糖SCP-0对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.7 Superoxide radical scavenging activity of SCP-0

2.2.3 对DPPH自由基（DPPH·）清除能力的测定抗氧化剂通过转移传递电子或氢原子给DPPH来中和其自由基，因此，对DPPH自由基的清除效果可以反映抗氧化剂的供氢能力。从图8可以看出，SCP-0对DPPH自由基的清除效果与其质量浓度紧密相关。SCP-0表现出了很强的DPPH自由基清除能力，其IC50为2.1 mg/mL，但仍不如对照样品VC强。抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用被认为与其供氢能力有关，因此，以上结果提示五味子多糖SCP-0可能具有较强的供氢能力。

图8 五味子多糖SCP-0对DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging activity of SCP-0

2.2.4 抗猪油氧化能力的测定 从图9可以看出，多糖组的POV在前6天增长较为缓慢，在这个阶段产生的自由基会被五味子多糖有效地清除掉，各样品组的POV都明显低于空白组，并且随多糖添加量的增大，对POV上升的抑制越明显（p＜0.05）。之后进入一个快速增长的阶段，各多糖组均表现出对氧化速度的难以抑制。从第14天开始，随着一些自由基碰撞结合生成双聚物，体系中的自由基数量有所减少，多糖组的自由基清除效果开始显现，使氧化的进程放缓，而空白组的POV曲线保持着传播期（6～14 d）陡峭上升的势头。TBHQ，作为一个已知的强效抗氧化剂，在整个试验时期都表现出非常强的抑制油脂氧化的能力。从以上结果可知，五味子多糖具有一定的抗油脂氧化能力，且抗氧化能力随用量的增加而提高，但与人工合成的抗氧化剂TBHQ相比仍有差距。

图9 五味子多糖SCP-0抗猪油氧化能力Fig.9 Antioxidative activity of SCP-0 on lard oxidation

3 结语

作者从五味子残渣中通过水提醇沉法提取得到五味子粗多糖，通过聚酰胺柱层析及Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析对五味子多糖进行纯化，得到纯度为94.6%的均一组分SCP-0，对其体外抗氧化活性研究表明:SCP-0对·OH具有较好的清除效果，IC50为14.5 mg/mL；对DPPH·具有较好的清除效果，IC50为2.1 mg/mL；但对·O2-无明显清除效果；具有一定的抗油脂氧化能力，在低自由基浓度水平下效果更明显。SCP-0具有开发为天然抗氧化剂的潜力。

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