多种酶复合制备鸡皮胶原蛋白短肽

曾庆冉， 张 慜*， 陈世豪

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2.广东嘉豪食品股份有限公司，广东 中山 528447）

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富、分布较广的蛋白质之一，其应用领域包括生医材料、化妆品、食品工业等[1]。对于人体，胶原蛋白的作用可以说毋庸置疑，无论是对于美容保养还是生命健康，胶原蛋白都发挥着重要作用。然而，由于胶原蛋白属大分子级别的蛋白质，具有十分稳定的三股超螺旋结构，从而造成其消化困难，不易被人体充分利用。研究表明，大量氨基酸是以2～6个氨基酸组成的寡肽形式被吸收，寡肽有助于肠道吸收。在氨基酸运输系统功能出现障碍的情况下，摄入寡肽却能获得很好的吸收效果。因此需要将胶原蛋白水解为相对分子质量较低的胶原短肽[2]。目前胶原蛋白水解方式分为酸法、碱法和酶法。而酶法水解比传统的酸法、碱法水解更加温和、安全、专一性强，并且时间短，无环境污染。

由于胶原蛋白多肽对增强防病抗病能力、延缓衰老等方面都具有深远意义，目前，开发和研究生物活性肽类食品在国际保健品行业中已成为一个焦点。富含胶原蛋白最多的原料是猪皮、牛皮、猪骨头和牛骨头。Siriporn Damrongsakkul等用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解牛皮提取胶原蛋白[3]，李兴武、章黎黎等利用猪副产物酶法制备胶原多肽[4]。然而，由于人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的安全性产生了质疑，因此目前工作就是寻找新的提取胶原多肽的原料来源[5]。贾冬英等也首次尝试从鲢鱼头及骨中提取胶原蛋白[6]。然而据了解，目前从鸡皮等禽源性皮中提取胶原蛋白还未见过多报道，而鸡肉在中国已成为仅次于猪肉的第二大肉类消费品。因此研究和开发从鸡皮中提取胶原蛋白不仅可以充分利用鸡皮资源，提高鸡肉产品的附加值，还能保护环境，扩大胶原蛋白的原料来源，同时拓宽了胶原蛋白的应用范围。因此，作者以鸡皮为原料，提取胶原蛋白多肽，旨在为进一步开发利用鸡皮提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鸡皮:取自无锡欧尚超市童子鸡。购买后清洗去皮，将鸡皮沥干后测其基本成分，结果见表1。

表1 原料的基本成分Table 1 Material's mainly composition

将沥干后的鸡皮用剪刀剪成小的正方形（1 cm×1 cm），然后将其放入自封袋中于-20℃冷冻保藏，保藏时间不能大于一个月。

1.2 试剂

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶Flavourzyme、复合蛋白酶PROTAMEX、水解蛋白酶Novozym 37071:诺维信生物技术有限公司。SDSPAGE超低相对分子质量标准品:上海源叶生物科技有限公司（相对分子质量范围3 313～20 100）；牛血清白蛋白、SDS、脲、过硫酸铵、丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、Tris、Tricine、TEMED、 氢氧化钠、氯化钠、正丁醇、盐酸、浓硫酸、硼酸、硫酸钾、硫酸铜、乙醚、三氯乙酸等试剂:均为分析纯。

1.3 仪器与设备

实验室pH计FE20:梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司；电子天平PL203:梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CJJ78-1型磁力加热搅拌器:金坛市大地自动化仪器厂；SIGMA2-16PK离心机:北京博励行仪器有限公司；HH-S型水浴锅:郑州长城科工贸有限公司；UV-9100型紫外可见光谱仪:北京瑞丽产品；U410超低温冰箱:New BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.；冷冻干燥机:作者所在实验室自行设计组装；DYY-8C型电泳仪:北京市六一仪器厂；氨基酸自动分析仪。

1.4 实验方法

1.4.1 原料预处理 由于鸡皮中含有一定的脂肪和杂蛋白质，因此在水解前需要去除杂蛋白质和脂肪。取剪碎后的鸡皮加入质量浓度为10 g/dL的NaCl溶液中（料液比为 1∶10），4 ℃搅拌浸提 12 h去除杂蛋白质，然后用蒸馏水反复清洗至pH值接近中性。用两层纱布过滤后加入质量浓度为10 g/dL的正丁醇溶液，4℃搅拌浸提24 h去除脂肪，用大量蒸馏水反复清洗得脱杂蛋白质和脂肪的鸡皮[7]。

1.4.2 鸡皮胶原蛋白肽制备工艺 将预处理后的鸡皮按料液比1∶10的比例加水，在一定条件下酶解，然后于85℃下灭酶10 min，灭酶后将酶解液迅速冷却至适温，经4 000 r/min离心10 min，取上清液浓缩，冷冻干燥后即得鸡皮胶原蛋白多肽[8-9]。

1.4.3 分析测定方法

1）水解度的测定:采用双指示剂甲醛滴定法[10]。

2）多肽含量的测定:将5 mL 10%三氯乙酸溶液添加到5 mL待测样品中，于旋涡混合仪上混合均匀，静置10 min，在4 000 r/min下离心20 min，取上清液用双缩脲法测可溶性氮含量[11]。

3）氨基酸含量及组成分析:准确量取5 mL胶原蛋白多肽溶液于水解管内，并加入6 mol/L盐酸10 mL，抽真空，封口，在110℃恒温干燥箱内水解24 h后取出。冷却后将水解液过滤后转移至50 mL容量瓶定容。吸取滤液1 mL于5 mL容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，最后蒸干，用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解后用氨基酸自动分析仪分析测定[12]。

4)多肽相对分子质量分布测定:用含脲的Tricine-SDS-PAGE 方法[13-15]。

聚丙烯酰胺凝胶制备见表2。先制备分离胶，聚合后再制备夹层胶，最后制备浓缩胶。三种胶长度比例 4∶1∶1.5。电泳时电压为 30 V；1 h后变为 100 V至结束。将胶在固定液中（0.5%戊二醛、30%乙醇加ddH2O到100 mL）固定30 min，再用考马斯亮蓝G-250系统染色30 min，然后用脱色液脱色。

表2 聚丙烯酰胺凝胶配方Table 2 Polyacrylamide gel formula

2 结果与分析

2.1 酶种类的选择

由于利用复合酶水解，提取率高且平均相对分子质量较小，因此为了能够得到较多相对分子质量较小的多肽，选用三种酶复合对鸡皮水解。选择比较了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶Flavourzyme、复合蛋白酶PROTAMEX、水解蛋白酶Novozym 37071的水解效果，以及两个酶复合的水解效果，从而选用1（木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+复合蛋白酶）、2（木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+风味蛋白酶）、3（木瓜蛋白酶+风味蛋白酶+复合蛋白酶）、4（Novozym37071蛋白酶+木瓜蛋白酶+风味蛋白酶）、5（胰蛋白酶+风味蛋白酶+复合蛋白酶）按 1∶1∶1 对鸡皮水解。取一定量预处理的鸡皮，按料液比1∶10加入蒸馏水，按鸡皮质量的1%加入复合酶，在50℃下酶解 3 h，灭活、离心、冷冻干燥，结果见图1。由图1可知，利用2（木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+风味蛋白酶）复合水解，在相同条件下，水解度和多肽含量最高，故采用木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+风味蛋白酶1∶1∶1复合水解。

图1 酶的种类对多肽水解效果的影响Fig.1 Effects of enzymatic types on peptide hydrolysis

2.2 pH值的影响

取一定量的鸡皮，按1∶10的料液比加入蒸馏水，按鸡皮质量的1%加入复合酶，在50℃，分别于pH 5～8.5下酶解3 h，考察pH值对肽水解效果的影响，结果见图2。由图2可知，在pH 5～8.5范围内，随着pH的变化，水解度和多肽质量浓度均有所不同，其中在pH 7时，多肽质量浓度最高，水解度较高；在pH 7.5时水解度最高，而多肽质量浓度有所下降，但下降不是很多。说明在pH 7～7.5时，复合酶的活性和稳定性最好，因此最适酶解pH为7～7.5。

图2 pH值对多肽水解效果的影响Fig.2 Effects of pH on peptide hydrolysis

2.3 酶解时间的确定

取一定量的鸡皮，按1∶10的料液比加入蒸馏水，调节pH值至7左右，按鸡皮质量的1%加入复合酶，在50℃下进行水解，分别酶解不同时间后，灭酶、离心、冷冻干燥。考察酶解时间对肽水解效果的影响，结果见图3。由图3可知，随着酶解时间的延长，水解度和多肽质量浓度也呈上升趋势，但3 h后水解度上升趋势减弱，且多肽质量浓度出现下降，这可能是由于多肽进一步水解为氨基酸的原因[16]。因此，在对相对分子质量大小影响不大的前提下，为了获得较多多肽，初步确定酶解时间为3 h。

图3 酶解时间对多肽水解效果的影响Fig.3 Effects of hydrolysis time on peptide hydrolysis

2.4 加酶量的确定

取一定量的鸡皮，按1∶10的料液比加入蒸馏水，调节pH值至7左右，按鸡皮质量的不同百分比加入复合酶，在50℃下酶解3 h，灭酶、离心、冷冻干燥。考察加酶量对多肽水解效果的影响，结果见图4。由图4可知，当加酶量较低时，水解度和多肽质量浓度会随加酶量的增加而快速上升，当加酶量为0.8%时，多肽质量浓度最大，但是当加酶量大于0.8%时，多肽质量浓度会随加酶量的增加而减少，而水解度也没用明显变化，这是因为当酶的浓度相对于底物浓度较低时，加大酶的用量可以有效加快酶解反应速度，但是当酶的浓度相对于底物浓度较高时，反应速率开始由底物浓度控制，所以继续增加酶的用量对水解度的影响不大。而相反，由于酶的浓度相对较大，从而使一部分多肽进一步水解为氨基酸，从而使多肽质量浓度降低。所以最适的加酶量为鸡皮质量的0.8%。

图4 加酶量对水解效果的影响Fig.4 Effectsofenzymeconcentrationson peptide hydrolysis

2.5 酶解温度的确定

取一定量的鸡皮，按1∶10的料液比加入蒸馏水，调节pH值至7左右，按鸡皮质量的0.8%加入复合酶，在不同温度下，酶解3 h，灭酶、离心、冷冻干燥。考察温度对多肽水解效果的影响，结果见图5。温度对鸡皮水解反应影响较大，在35～50℃时，水解度随着温度升高不断增大，多肽质量浓度也不断增加，在50℃时达到最大，当温度高于50℃时水解度开始下降，多肽质量浓度降低。这是因为温度对酶解反应速度具有双重影响，升高温度可加快酶解反应速度，同时当温度过高时，酶容易变性，酶活力容易降低，故采用温度为50℃进行酶解。

图5 酶解温度对多肽水解效果的影响Fig.5 Effects of hydrolysis temperature on peptide hydrolysis

2.6 最佳酶解条件的确定

在初步确定酶解条件的基础上，选择酶解时间、pH值、加酶量和温度等因素，并以多肽质量浓度为评判指标进行正交试验，试验安排及结果见表3。由表3可知，各因素对水解效果影响的顺序为温度＞加酶量＞酶解时间＞pH值，其最佳工艺组合为pH 7，温度45℃，酶解时间3 h，加酶量0.9%。鸡皮在该条件下酶解，其水解液中多肽质量浓度最高，可达1.32 mg/mL。

2.7 鸡皮胶原蛋白肽的理化分析

2.7.1 多肽氨基酸含量及组成分析 胶原蛋白多肽的氨基酸组成见表4。从表4可以看出，在鸡皮胶原蛋白多肽中共含有18种氨基酸，其中甘氨酸所占比例最大，占21.63%，与脯氨酸比例约3∶1，复合胶原蛋白氨基酸的基本构成。脯氨酸次之，约占13.17%，而羟脯氨酸是胶原蛋白特有的一种氨基酸，对于稳定胶原蛋白的三螺旋结构起到一定作用。另外，从表4中还可以看出，胶原蛋白中不含色氨酸，几乎不含半胱氨酸。说明酶解的胶原蛋白中几乎不含其他型胶原蛋白质。而苯丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸的质量分数较低，符合胶原蛋白质的性质[17]。

表3 优化酶解条件正交试验设计及结果Table 3 Design and results of orthogonal experiment for optimization of hydrolysis conditions

2.7.2 多肽相对分子质量测定 胶原蛋白多肽的SDS-PAGE电泳图见图6。M为超低相对分子质量标准蛋白质和多肽:从下至上分别是3 313、5 856、7 823、14 400、20 100。 Tricine-SDS-PAGE 结果显示:位于5 856～20 100之间没有明显条带，而在3 313～5 856之间有明显的两条带，在3 313稍下部分有一条带，说明酶解多肽的相对分子质量主要集中在2 000～5 000之间。

表4 胶原蛋白多肽的氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of collagen polypeptides

图6 胶原蛋白多肽的SDS-PAGE电泳图Fig.6 SDS-PAGE electrophoretogram ofcollagen polypeptide

3 结语

以鸡皮为原料，采用酶水解法提取胶原蛋白多肽，并用正交实验对胶原蛋白肽的提取工艺进行优化，并测定了鸡皮的基本组成成分和多肽的氨基酸组成相对分子质量。结果表明，采用木瓜蛋白酶+胰蛋白酶+风味蛋白酶复合水解，当在pH为7，加酶量为0.9%，酶解温度为45℃，酶解时间3 h时，水解度最好，多肽含量最大。

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