食品和饲料中火鸡源性成分的实时荧光PCR检测方法

张舒亚， 谌鸿超， 宋 青， 高 琴，吕 蓉， 李 想， 刘月明， 李富威

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.上海海洋大学 食品学院，上海201306）

在动物产品原料和加工产品中，经常出现成分的掺假造假和无意污染现象。人为搀假主要是不法商要降低成本或增加品质，以谋取巨额经济利益，如三聚氰胺奶粉、地沟油、染色馒头事件等，这是欺诈违法行为。这种掺假造假、以次充好的行为除了严重扰乱我国经济秩序，另一个最主要影响是危害人体健康和畜禽安全。在加工产品的造假掺假过程中，经常会使用有毒有害物质（如染色馒头等），危害人民身体健康。疯牛病和禽流感的世界性爆发和流行，人们越来越关注食品安全和饲料安全。部分人群因为健康缘故也只食用素食部分。疯牛病的发生是由于反刍动物食用了含有动物成分的饲料，所以各国禁止含有动物成分的饲料喂养动物。由于含有禽成分的饲料可能具有传播禽流感的风险，用这些掺假的饲料喂养动物，会影响畜禽的健康生长及我们的畜牧业安全。《中华人民共和国产品质量法》、《中华人民共和国食品卫生法》和《食品标识管理规定》（国家质量监督检验检疫总局令第102号）等法律法规禁止产品的造假掺假行为和正确标识食品标签。

为保持产品的真实性，国内外研究学者建立了食品和饲料中牛、羊、猪等多种物种成分以及鱼翅等高附加值产品的检测方法[1-9]。目前对火鸡源性成分检测研究报道还不多，国内还未见火鸡源性成分检测的研究报道。作者采用实时荧光PCR检测方法对火鸡成分进行鉴定，确保火鸡及相关产品的真实性，该方法的推广应用对保障产品质量安全，保护消费者知情权和选择权，打击掺假造假违法行为和保护畜牧业健康发展等提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

火鸡、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子、鹌鹑、牛肉、猪肉、山羊肉、绵羊肉、梅花鹿肉、骆驼肉、马肉、驴肉、兔肉、野兔肉、野猪肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草虾、螃蟹、甲鱼、牡蛎、贻贝、蜗牛等27种动物材料:购自上海市农贸市场或超市；大豆、玉米、大麦、小麦、大米、马铃薯、番茄、豌豆、苹果、胡萝卜等10种常见植物材料:购自上海市农贸市场或超市；15批进口冻火鸡腿肉、火鸡脯肉和火鸡颈肉，10个进口未标识火鸡成分的食品（包括面包、香肠、饼干等），20批鸡肉骨粉饲料，20批其他成分饲料（包括猪肠膜蛋白粉、多福蛋白、乳清粉、宠物饲料等）:由作者所在实验室保存。2个国内市场火鸡产品，各6种鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等30种禽肉和蛋产品，20批其他成分食品（肉干、肉酱、饼干、罐头等）:购自上海市农贸市场或超市。

1.2 试剂

CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0。蛋白酶K:20 mg/mL。CTAB沉淀溶液:5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl。氯仿（三氯甲烷）。70%乙醇。TE 缓冲液（Tris-Cl、EDTA 缓冲液）:10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。 实时荧光PCR混合液:Taqman Gene Expression Master Mix（AB 公 司 ，Part No.4369016）。 PCR 预 混 合 液:Premix Ex Taq Version2.0 （TaKaRa 公 司 ，Code:D332A）。 超纯水（ddH2O）。

火鸡源性检测正向引物:5’-GCC CTA ACC CCT TAA GAA AAG AAT-3’，反向引物:5’-AGT TGC TAT GGC TAA GTC AAG TTT ACA C-3’，探针:5’-FAM-CTT GCT TGA GCC ACA CC-MGB-3’。

18S rRNA检测引物:5’-TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3’ 和 5’-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3’。

1.3 仪器设备

ABI 7300实时荧光PCR仪，天平，移液枪，离心机，恒温孵育器，冷冻碾磨机，DNA冷冻干燥离心机，核酸蛋白浓度分析仪，Eppendorf离心管，PCR反应管。

1.4 样品的制备

用冷冻研磨机将上述植物材料和动物材料样品研磨成粉状。使用冷冻研磨机将鸡肉和火鸡肉磨成粉末状，并于60℃烘干3 h。用鸡肉粉与火鸡肉粉混合，配制成分别含有质量分数10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.000 1%火鸡肉粉的混合样品。

1.5 DNA的提取

将样品研磨后，称取100 mg样品于2 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB提取缓冲液和10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）溶液。60℃振荡过夜后13 000 g离心10 min，转移上清液到新的离心管中。加入750 μL氯仿后用力振荡，13 000 g离心5 min，将上清转移到新的离心管中。加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60 min，13 000 g离心15 min，弃去上清。加入350 μL NaCl溶液将沉淀进行悬浮。再加入350 μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13 000 g离心10 min。转移上清液后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20 min，13 000 g离心10 min，弃去上清液。加入500 μL 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200 μL TE溶液中，用核酸蛋白含量测定仪测定DNA浓度，也可用等效的商业化DNA提取试剂盒提取模板DNA。

1.6 DNA浓度测定及配制

用德国Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白浓度分析仪测定抽提样品DNA的质量浓度。

用鸡肉DNA溶液（质量浓度100 ng/μL）将抽提的火鸡肉 DNA溶液（浓度 100 ng/μL）稀释成 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL DNA 混合液，用于灵敏度测试。

1.7 PCR测试

过敏原大豆成分实时荧光PCR检测的反应体系:实时荧光PCR混合液12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，探针（5 μmol/L）0.5 μL，模板 DNA 100 ng，水补足至25 μL。实时荧光PCR反应循环参数:50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40 个循环。

18S rRNA基因引物PCR反应体系:PCR预混合液 12.5 μL，引物（5 μmol/L）各 0.5 μL，模板 100 ng， 反应体积为 25 μL。扩增条件为:94℃，3 min；94 ℃，20 s，54 ℃，40 s，72 ℃，40 s，40 个 循环 ；72℃，5 min。取 10 μL PCR 产物，加 1 μL 10×上样缓冲液点样进行琼脂糖凝胶电泳。PCR产物电泳检测所用的凝胶质量浓度为1.5～2.0 g/dL。

2 结果与分析

2.1 真核生物特异引物18S rRNA引物的检测结果

18S rRNA基因在真核生物中高度保守，18S rRNA基因特异引物在真核生物DNA中均能有效扩增，常用于真核生物的内参照基因。用真核生物18S rRNA特异引物扩增本实验提取的所有DNA溶液（包括各种动物或植物材料的DNA溶液），所有DNA溶液均能出现137 bp的特异扩增条带。结果表明，所有抽提的DNA溶液适合于PCR测试。

2.2 火鸡成分的实时荧光PCR特异性检测

以火鸡12S rRNA基因为靶标，设计火鸡检测引物和探针序列。用火鸡源性检测引物对火鸡和供试的其他动物和植物进行检测，在火鸡DNA中出现扩增，而在鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子、鹌鹑、牛肉、猪肉、山羊肉、绵羊肉、梅花鹿肉、骆驼肉、马肉、驴肉、兔肉、野兔肉、野猪肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草虾、螃蟹、甲鱼、牡蛎、贻贝、蜗牛、大豆、玉米、大麦、小麦、大米、马铃薯、番茄、豌豆、苹果、胡萝卜等36种常见动植物材料DNA样品中均无扩增，见图1。这说明该检测方法具有物种特异性。

图1 火鸡源性引物探针特异性实时荧光PCR检测图谱Fig.1 Specific detection of real-time PCR for turkey

2.3 火鸡成分的实时荧光PCR检测灵敏度

对 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL火鸡 DNA 进行检测， 在 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL火鸡DNA中出现扩增，在0.000 01 ng/μL火鸡DNA中未出现扩增，见图2。实验表明，火鸡源性检测引物检测灵敏度为0.000 1 ng/μL火鸡DNA。

图2 火鸡DNA实时荧光PCR检测灵敏度图谱Fig.2 Amplification curve generated by serial dilution of turkey DNA

用鸡肉粉10倍系列混合配制不同含量的火鸡肉粉样品。使用火鸡成分引物和探针对质量分数10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和 0.0001%火鸡肉粉的样品DNA进行检测。10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%火鸡肉粉均出现扩增曲线，而0.000 1%火鸡肉粉未出现扩增曲线，见图3。实验表明，该方法的检测灵敏度为0.001%（10 mg/kg）火鸡肉粉。

图3 火鸡肉粉质量比的实时荧光PCR检测灵敏度图Fig.3 Amplification curve generated by different turkey percentage

2.4 食品中火鸡成分检测的应用

使用建立的检测方法对15个进口火鸡产品、10个、52个国内市场流通的市售食品以及进口40批饲料进行检测，以验证检测方法的实际应用性。经对117个食品和饲料样品进行检测，在15批进口样品和2个国内火鸡产品中检测出火鸡成分，检测结果与食品成分相符；在10个进口未标识火鸡成分的食品，国内市场的30个禽肉蛋制品和20批其他成分食品中未检出火鸡成分，检测结果与食品成分相符；在1批美国进口的鸡肉骨粉饲料检出火鸡成分，在其他的19批鸡肉骨粉饲料和20批其他成分饲料未检出火鸡成分，见表1。结果表明，研究建立检测方法能够适用于食品和饲料的火鸡源性成分检测。

表1 食品和饲料中火鸡源性成分检测结果Table 1 Test results of commercial food and feed samples

3 结语

目前对物种成分的鉴定，基本上是采用生物技术手段，以蛋白质为基础的检测技术（如ELISA）和核苷酸为基础的检测技术（如PCR）。PCR检测方法由于其高特异性和高灵敏度广泛应用于加工产品（尤其是深加工产品）的检测[1-13]。12S rRNA基因序列由于保守特异而常被选用于动物源性成分鉴别，I Martín 和 Miguel A Rodríguez 报 道 了 以 12S rRNA为检测靶标的火鸡普通PCR检测方法[11-12]，其检测限为0.1%～1%。2012年Zulal Kesmen报道了基于火鸡NADH脱氢酶检测靶标的检测方法，其检测限为0.001%[13]。作者以火鸡12S rRNA基因为靶标，研究建立了食品和饲料中火鸡成分实时荧光PCR检测方法，特异性强，灵敏度高，检测限为0.001%（10 mg/kg），能准确检测出食品和饲料中的火鸡成分，为食品和饲料中火鸡成分检测方法标准化提供了依据。

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