经圆窗应用地塞米松对豚鼠庆大霉素耳毒性的拮抗作用△

张慧平 李荧 王建锋 苏纪平

氨基糖苷类抗生素可能导致严重的不可逆性耳毒性副作用，从而限制了其在临床的应用。临床证实糖皮质激素是治疗突发性聋、自身免疫性感音神经性聋等的有效药物之一[1，2]。有研究表明[3]，全身应用地塞米松对庆大霉素耳毒性有明显的保护作用，但尚未见局部用药的报道。本研究将地塞米松经豚鼠圆窗和全身两种方式给药后，观察其对庆大霉素致豚鼠耳中毒的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1实验动物分组及处理 选用耳廓反射灵敏、听力正常的健康花色豚鼠60只，体重350～400 g，雌雄不限，随机分为四组，每组15只：①庆大霉素组，仅肌注硫酸庆大霉素注射液(8万单位/支，海南制药厂有限公司)120 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天；②全身用药组，肌注硫酸庆大霉素120 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天，同时腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液(无锡第七制药有限公司) 2.5 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天；③局部用药组，肌肉注射硫酸庆大霉素120 mg·kg-1·d-1，1次/天，共10天，在实验第一天，于右耳圆窗局部放置浸地塞米松的明胶海绵1次；④对照组，肌注与庆大霉素等体积的生理盐水，1次/d，共10天，在实验第一天，于右耳圆窗局部放置浸地塞米松的明胶海绵1次。所有动物实验期间每天称体重调整庆大霉素的用药量。于实验前、停药后第1天和第10天分别检测各组动物的听性脑干反应(ABR)，实验结束时观察中耳粘膜情况，并采用扫描电镜(JSM-T300，日本电子公司)观察耳蜗毛细胞的改变。

1.2经圆窗局部给药方法 动物用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒、铺单，做右耳后切口约2 cm长，暴露听泡。手术解剖显微镜下在听泡上钻孔并扩大，暴露圆窗龛，以明胶海绵颗粒(0.2 cm×0.3 cm) 浸地塞米松(5 mg/ml)约0.1 ml置于圆窗龛内并接近圆窗膜表面，然后关闭术腔，缝合切口。

1.3听性脑干反应(ABR)测试 动物用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，使用听觉诱发电位系统(美国HIS公司Intelligent Hearing System Smort EP2.22)，记录电极置于双侧耳廓前缘连线中点头顶部皮下，参考电极置于同侧耳垂，鼻尖接地。插入式耳机气导给声，短声刺激，刺激速率21.1次/秒，带通滤波100～3 000 Hz，扫描时间10 ms，叠加次数512次。测试声从80 dB SPL开始，以5 dB逐项递减或递增，以能引出明确的、可重复的波Ⅲ的最小刺激强度为ABR反应阈。

1.4中耳粘膜观察 豚鼠深麻醉后断头，取出听泡，显微镜下观察鼓室粘膜有无增厚、充血，鼓室内有无肉芽增生、渗出液及圆窗膜有无明显增厚。

1.5扫描电镜观察耳蜗方法 每组随机取两只动物，断头取右侧听泡，暴露耳蜗，打开卵圆窗和圆窗，垂直于蜗轴用细针在蜗尖处钻孔，用吸管从蜗尖向蜗内轻轻滴注2.5%戊二醛溶液3～5管，然后将标本放入相同固定液内置于4 ℃冰箱内固定4 h以上。取基底回Corti器送电镜室处理,并行扫描电镜观察。

1.6统计学方法 采用SPSS12.0 for windows统计软件，组间比较采用t检验及方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组动物生长情况 实验过程中各组均有动物死亡，其中，庆大霉素组死亡6只，全身用药组死亡7只，局部用药组死亡5只，对照组死亡6只。使用庆大霉素的各组动物体重都有不同程度的减少。庆大霉素组动物消瘦，食欲差，行动迟缓，被毛蓬松，整个实验过程中体重减轻8.37±4.83 g，与其他三组比较差异均有显著统计学意义(P<0.001)。全身用药组和局部用药组动物食欲下降，活动尚可，停药后体重缓慢增加，实验过程中体重分别增加11.0±4.67 g和12.75±7.68 g，分别与其他两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，但这两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。对照组动物行动活泼，食欲好, 整个实验过程中体重增加22.22±4.23 g，与其他三组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.2中耳粘膜观察结果 四组动物鼓室粘膜均无增厚、充血，鼓室内洁净，无渗出液、无肉芽组织增生，没有观察到明显的圆窗膜增厚现象。停药后第1天，术耳听泡内偶见有少许明胶海绵颗粒残留，停药后第10天均未发现明胶海绵残留。本研究中，发现死亡动物中3只有中耳感染，但未计入结果中。

2.3ABR检测结果 停药后，对照组动物ABR反应阈无明显变化，其他三组动物的ABR反应阈均较实验前升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)，其中以庆大霉素组升高最显著，并随着时间延长升高更明显。停药第1天，庆大霉素组、全身用药组与局部用药组之间ABR反应阈差异无统计学意义(P>0.05)；停药第10天，庆大霉素组和局部用药组之间ABR反应阈差异有统计学意义(P<0.05)，与全身用药组差异无统计学意义(表1)。

表1 四组动物用药前后ABR反应阈

注：与庆大霉素组比较，#P<0.05，##P<0.01；与前一个测试时间点比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4耳蜗扫描电镜观察结果 对照组豚鼠耳蜗各回内外毛细胞静纤毛排列整齐、形态正常、无缺失，外毛细胞静纤毛略呈W形，内毛细胞静纤毛略呈弓形。庆大霉素组豚鼠耳蜗底回可见广泛的外毛细胞缺失，外毛细胞静纤毛束消失，散在的听毛排列紊乱、倒伏严重，大面积的融合、扭曲、缺失或残缺不全，病变范围见于第一排到第三排外毛细胞。与庆大霉素组相比,全身用药组、局部用药组豚鼠耳蜗毛细胞损伤程度明显减轻，仅见底回第一排、第二排外毛细胞有小面积的缺失，停药第10天时最为显著(图1)。

图1 停药10天后各组动物耳蜗底回毛细胞扫描电镜图(×3 500)

3 讨论

地塞米松减轻庆大霉素耳毒性的作用机理比较复杂，一般认为通过以下几方面起作用[4,5]：①通过抗炎因子脂皮质素I抑制磷酸酶A2，影响花生四烯酸的连锁反应，进而抑制炎症介质和细胞因子的合成；②它可以清除体内的自由基，具有明显的抗脂质过氧化物作用；③抑制一氧化氮合成酶和环氧化酶2(Cox-2)的产生；④促进糖原异生，并利用蛋白质分解产生的更多的氨基酸合成糖原；⑤局部应用可以改善微循环，增加耳蜗血流量从而促进血管纹代谢，加强淋巴液中蓄积药物的转运；⑥抑制钙和钠的跨膜运转, 稳定细胞膜和溶酶体膜，并减少细胞内游离钙浓度，但极少影响蛋白的合成。

近年来，国内外学者研究均证实，与全身给药相比，经圆窗局部应用糖皮质激素可以在内耳中获得更高的药物浓度并且维持时间也更长[6～11]。苏纪平等[8]报道，经圆窗局部给泼尼松龙后，外淋巴的峰值浓度较全身给药高100倍；孙爱华等[10]发现，大剂量静脉给地塞米松后，外淋巴峰值浓度是235 μg/L，而鼓室灌注地塞米松给药，其内淋巴峰值浓度是8 345 μg/L；侯东明等[11]以明胶海绵颗粒浸地塞米松溶液置于两侧圆窗膜45 min后，发现外淋巴液中的药物浓度显著高于全身用药组，局部用药的生物半衰期为2.67 h。本实验采用经圆窗局部给地塞米松后，对照组动物在实验前、停药第一天和停药第十天的ABR反应阈变化均无明显差异，同时，扫描电镜也没有观察到毛细胞受损害的表现，且各组动物中耳粘膜正常、鼓室内洁净，没有观察到明显的圆窗膜增厚现象，表明本实验采用的局部给地塞米松的方法对耳蜗功能和形态均未构成损害。本实验中，置于圆窗龛中的明胶海绵颗粒被保留(约7天)，可以推测明胶海绵作为一种缓释材料，可以使地塞米松持续经圆窗膜渗透进入内耳，量效更高，可以在外淋巴液中达到更高的药物浓度和更长的半衰期，此有待今后作进一步的药代动力学分析。

本实验结果显示，停药第10天，无论在耳蜗形态学表现，还是听功能检测结果方面，单纯使用庆大霉素组的耳蜗损害均明显重于局部用药组(P<0.05)，表明经圆窗局部用地塞米松可以在一定程度上减轻庆大霉素对耳蜗的损害。本研究还发现，停药后第1、10天，局部给药组ABR反应阈低于全身用药组，虽然差异没有统计学意义，但随时间推移其差异有逐渐增大趋势，如果在停药后更长时间检测，其差异性或许会表现得更显著。本研究在预实验中也设计了停药30天组，但发现实验时间越长，动物死亡越多，在停药30天时，动物几乎全部死亡，因此舍弃了这个测试点。局部给药组与全身给药组动物耳蜗形态学上差异没有听功能检查的差异大，其可能原因是大剂量的庆大霉素致聋时，其作用部位是多方面的，可以同时作用于耳蜗毛细胞和螺旋神经节及听觉中枢系统其他部位，形态学仅观察了毛细胞，而听功能检查反映听觉系统的综合功能，因此差异更大。此外，还可能与形态学损害较功能损害滞后有关。尽管本实验经圆窗给药的方法能使耳蜗内有高的药物浓度和较长的持续时间，但也难以完全拮抗庆大霉素的耳毒性，提示要进一步减轻庆大霉素的耳毒性，可能要求激素能在局部达到更高的浓度和更长的作用时间。

朱新波等[3]动物实验表明，全身用地塞米松对庆大霉素的耳毒性有明显的保护作用。本研究中，全身应用地塞米松组较单纯用庆大霉素组动物耳蜗形态学损害减轻，ABR反应阈相对较低，但无统计学差异，与朱新波等[3]结果存在差异，推测有以下几方面的原因：① 本研究使用的庆大霉素的剂量较大(120 mg·kg-1·d-1，持续10天)，而他们的用量仅为20 mg·kg-1·d-1，持续14天。此外，Tran Ba Huy等[4]对庆大霉素的药代动力学研究显示，给SD大鼠单次肌肉注射庆大霉素100 mg/kg,其在耳蜗中的生物半衰期为13.3 h,5天以后耳蜗中检测不出药物。而本实验的给药方式所致豚鼠耳毒性的损害程度要较其他实验为重，且停药后听力损失仍在加重；②本研究全身给地塞米松的剂量(2.5 mg·kg-1·d-1)与他们研究中所用量(10 mg·kg-1·d-1)相比明显偏小，因为预实验发现使用大剂量的地塞米松时，动物出现不明原因的死亡，到达实验终点的动物很少；③ 统计样本量不足或其他尚不明确的因素。总之，本研究结果说明，地塞米松局耳蜗圆窗局部应用和全身用药对于庆大霉素致聋豚鼠均有改善听力的作用，其对庆大霉素耳毒性的拮抗作用可能具有剂量依赖性。

4 参考文献

1 Wilson WR, Byl FM, Laird N. The efficacy of steroids in the treatment of idiopathic sudden hearing loss. A double-blind clinical study[J]. Arch Otolaryngol, 1980,106:772.

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3 朱新波，金晓冬，董缪武，等. 地塞米松对庆大霉素和丁胺卡那霉素所致豚鼠耳毒性的保护作用[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2003,8:659.

4 Tran Ba Huy P, Bernard P, Schacht J. Kinetics of gentamicin uptake and release in the rat. Comparison of inner ear tissues and fluids with other organs[J]. J Clin Invest, 1986,77:1 492.

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7 Bachmann G, Su J, Zumegen C,et al. Permeability of the round window membrane for prednisolone-21-hydrogen succinate. Prednisolone content of the perilymph after local administration vs. systemic injection[J]. HNO, 2001,49:538.

8 苏纪平，Bachmann G，唐安洲，等. 局部和全身给药后泼尼松龙在外淋巴液中的浓度分析[J]. 临床耳鼻咽喉科杂志, 2003,17:615.

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10 孙爱华,Freenma DJP.不同用药途径地塞米松在内耳液中的分布[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志,2001,36:62.

11 侯东明, 吴皓, 杨军,等. 不同方式鼓室内给药后豚鼠耳蜗外淋巴液中地塞米松代谢动力学特征[J]. 临床耳鼻咽喉科杂志,2001,19:307.