弥漫性脑外伤大鼠听功能及耳蜗形态学改变的实验研究△

邓艳丽 张再兴 刘建新 付兴华 李倩 刘颖 张萍 顾洪兰 卢鹤翔 孙瑞军

弥漫性脑外伤(diffuse brain injury，DBI)是临床上常见的外伤性疾病，有关DBI的发生机制目前不详[1，2]，有学者根据脑外伤损伤程度不同，对脑外伤后听功能变化进行了相关研究[3]，但有关弥漫性脑外伤后听功能及内耳形态学变化未见报道。为进一步研究DBI致内耳损伤的可能机制，本研究拟通过制作SD大鼠DBI模型，应用光镜、电镜观察DBI后其内耳形态学改变，并检测其ABR、40 Hz AERP、ASSR，以评估其听功能变化，以期为临床上弥漫性脑外伤患者的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康SPF级SD大鼠150只[由中国医学科学院实验动物研究所提供，动物编号：SCXK(京)2006-0003]，体重250～270 g。将其随机分为5组，每组30只(60耳)，即正常对照组和DBI后1、2、3、4周组。实验大鼠均在河北联合大学SPF级实验动物中心饲养。

1.2DBI模型的制作及行为学评分 正常对照组不做任何处理。其余各组动物参考Feeney造模方法[4]，将大鼠用乙醚麻醉，待其清醒前期，将大鼠取俯卧位固定于打击装置套管下的海绵床上，将质量为490 g的砝码自固定的1m高度处自由落下，打击于大鼠颅顶部直径20 mm、厚约3 mm的金属片上，制作SD大鼠DBI模型，打击后参照Schabitz评分标准[5]进行行为学评估以判断是否造模成功。

1.3ABR、40 Hz AERP、ASSR测试 对照组及DBI后1、2、3、4周组大鼠分别于相应的时间点进行ABR、40 Hz AERP及ASSR测试。

采用美国ICS medical公司生产MCV-90XP型脑干诱发电位仪测试ABR，click短声单耳刺激，刺激声强度由80 dB HL开始记录，以5 dB间隔递减，以能引出波Ⅴ的最小刺激声强为ABR反应阈。40 Hz AERP测试采用短纯音单耳刺激，扫描时间100 ms，滤波范围10～200 Hz，刺激频率39.1次/s，叠加500次，刺激声为1 000 Hz短纯音，检测1 kHz反应阈。ASSR测试双耳刺激声的载波频率分别为1、2和4 kHz，调制频率左耳依次为85、93、101 Hz，右耳依次分别为89、97、105 Hz，刺激声强度间隔为10 dB，每频/次扫描时间3 min，测试1、2、4 kHz反应阈。

1.4光镜、电镜耳蜗标本制作 各组大鼠测试ABR、40HzAERP及ASSR后断头处死，打开听泡，暴露耳蜗，在25倍显微镜下于蜗顶部用耳科纤维手术器械挑开一孔，取下镫骨暴露前庭窗，用10%多聚甲醛灌注固定，灌注数次后将标本置于10%多聚甲醛固定液置于4℃冰箱内保存备用。

选取多聚甲醛备用固定耳蜗标本， 10%EDTA脱钙10～14天，PBS清洗，石蜡包埋，平行蜗轴切片，光镜观察。电镜标本制作则灌注2.5%戊二醛数次，标本在显微镜下剔除骨蜗管骨壁，充分暴露基底膜， 2.5%戊二醛固定、4℃冰箱内保存备用。透射电镜标本：浸透包埋，半薄切片定位，超薄切片,厚度70～80 nm，醋酸双氧铀枸橼酸铅双重染色待检。

1.5统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件采用单因素方差分析进行组间差异比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DBI动物的行为学评估 DBI造模成功的大鼠均有竖毛、全身肌张力增高、四肢抽搐、尿失禁、鼻出血、眶周皮下淤血等表现，并出现不同程度的瞳孔改变和意识障碍，均有轻重不一的呼吸抑制，严重者经胸部按压部分恢复呼吸；部分出现了严重的呼吸抑制，剧烈抽搐后迅速死亡，1周组死亡4只，2周组死亡4只，3周组死亡6只，4周组死亡5只，死亡大鼠另取同等条件、同周大鼠补充。

2.2ABR、40 Hz AERP、ASSR测试结果 正常对照组ABR、40 Hz AERP及ASSR各反应阈均明显低于DBI各组(均P<0.05)；DBI 1周组三种检测的反应阈均高于3、4 周组(均P<0.05)，但均与2周组差异无统计学意义(P>0.05)；DBI 2周组与DBI 3、4 周组比较，除为3周组ABR波Ⅴ反应阈差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各项检查结果差异均有统计学意义(均P<0.05)(见表1)。

2.3各组耳蜗光镜、扫描电镜、透射电镜观察结果

2.3.1光镜观察 正常组三排外毛细胞排列整齐，内毛细胞无肿胀(图1a)。DBI后各组耳蜗前庭阶、鼓阶内出血，前庭膜向前庭阶突出，螺旋隧道增宽，外毛细胞肿胀，螺旋神经节间出血，耳石器形态破坏，耳石脱落(图1b、1c、1d、1e)。

2.3.2扫描电镜观察 正常组外毛细胞静纤毛呈V形排列，近蜗底处纤毛较短，近蜗顶处纤毛较长，排列有序(图2a)。DBI 1周组底回外毛细胞排列整齐，静纤毛出现聚集、少许倒伏现象，中、顶回静纤毛无序排列、倒伏，并出现三排外毛细胞静纤毛由外向内脱落缺失(图2b)；DBI 2周组中、顶回外毛细胞静纤毛排列紊乱，倒伏明显(图2c)；DBI 3周组耳蜗底回外毛细胞V字形静纤毛之间部分出现分离，少量融合、整体排列整齐，中、顶回外毛细胞静纤毛倒状，内毛细胞轻度倒状(图2d)；DBI 4周组底回外毛细胞V字形,中、顶回静纤毛排列紊乱，融合聚集成束、部分倒伏(图2e)。

表1 对照组与DBI各组ABR、40 Hz AERP、ASSR反应阈比较

注：*与DBI各组比较，P<0.05；**与DBI 1、2周组比较，P<0.05；△与DBI 4周组比较，P<0.05；#与DBI 1、4周组比较，P<0.05

2.3.3透射电镜观察 正常组耳蜗外毛细胞胞膜完整，表皮板表面光滑，静纤毛排列整齐，表皮板下方胞体内可见线粒体、溶酶体、内质网等细胞器(图3a)；DBI 1周组外毛细胞胞膜完整，部分外毛细胞肿胀，细胞质内线粒体出现线粒体嵴断裂、空泡样改变(图3b)；DBI 2周组外毛细胞胞膜完整，纤毛排列不齐，线粒体明显减少(图3c)；DBI 3周组外毛细胞胞膜完整，可见外毛细胞胞体肿胀，纤毛排列不齐，细胞质内细胞器减少，溶酶体增多(图3d)；DBI 4周组外毛细胞胞膜完整，胞体皱缩、细胞质内空化，纤毛尚整齐，表皮板下方及细胞质内细胞器均明显减少(图3e)。

图1 正常组和DBI各组大鼠耳蜗HE染色图(HE×100)

a 正常组内外毛细胞结构清楚； b DBI 1周组前庭阶、鼓阶内出血，螺旋器形态改变； c DBI 2周组鼓阶内可见血性物；d DBI 3周组外毛细胞排列列不齐，前庭膜向前庭阶突出； e DBI 4周组外毛细胞排列不齐,支持细胞变性

图2 正常组和DBI各组大鼠耳蜗扫描电镜图(SE×3 000) a 正常对照组； b DBI 1周组； c DBI 2周组； d DBI 3周组； e DBI 4周组

图3 正常组和DBI各组大鼠耳蜗投射电镜图(TE ×8 000) a 正常对照组； b DBI 1周组； c DBI 2周组； d DBI 3周组； e DBI 4周组

3 讨论

有研究证实DBI后听通路髓鞘结构不规则，轴突周围间隙扩大，髓鞘分解；神经元周围细胞器增加，神经变性或脑组织水肿[6,7]。文中结果显示DBI后1～3周时，大鼠的耳蜗中、顶回外毛细胞纤毛倒伏明显，螺旋神经节细胞内线粒体嵴断裂或呈空泡变性，而在第4周时耳蜗外毛细胞及螺旋神经节损伤减轻；说明DBI可以导致动物的耳蜗结构明显受损。王文利等[8]对脑震荡动物模型进行了形态学研究，电镜观察显示其耳蜗中、底回损伤明显，而从本研究结果看，DBI后大鼠耳蜗底回外毛细胞损伤较中、顶回轻，二者差异可能与动物模型及观察时程不一致有关，同时也提示弥漫性脑外伤致耳蜗低频区的损伤可能比高频区更明显或出现更早。

Modla等[9]研究表明形态学研究能帮助了解结构与功能的相互关系，Tokui等[6]在豚鼠脑外伤的实验中证实脑外伤后1天豚鼠的ABR反应阈未发生改变，伤后第7天其ABR反应阈明显升高，至第14天时，动物的ABR反应阈完全恢复正常；电镜观察显示伤后第1天神经髓鞘结构不规则，轴突周围间隙扩大，第7天髓鞘分解，伤后第14天这些改变部分恢复。本实验结果显示DBI大鼠第1～3周耳蜗损伤明显，至第4周时损伤减轻，而从听功能检测结果看，DBI后第 1周时，大鼠的ABR、40 Hz AERP、ASSR反应阈均较正常组升高，至第2、3周时各反应阈升高更明显，而到第4周时各项检查的反应阈略降低。以上一方面说明DBI导致的耳蜗受损形态学变化与听功能改变具有一致性，另一方面也提示DBI导致的耳蜗损伤可能是可逆的。

Johanson等[10]研究表明，DBI后的修复机制涉及神经生长因子及神经蛋白表达升高，并与缺血再灌注损伤、神经生长肽的变化密切相关；脑外伤后的病理学变化导致脑脊液中神经生长因子及神经肽浓度升高，进而引起脑组织自身的修复。Finnien等[11]研究发现脑外伤后的恢复受脑组织的发育阶段和神经修复的影响。随着观察时间的延长，本研究中DBI四周组大鼠的听功能有所恢复，耳蜗损伤的形态学变化有所减轻，分析其原因，可能是DBI早期缺血再灌注损伤、脑组织水肿，进而导致颅内压升高，而这种变化会随着时间的推移，触发神经修复的反馈机制，神经生长因子及神经肽的修复作用使脑组织水肿减轻，耳蜗毛细胞水肿变性减轻。因此，推断DBI致耳蜗损伤可能是可逆的，由于本研究观察时程为4周，DBI组的耳蜗形态及听功能受损均尚未恢复至正常水平，是否随恢复时间的延长，DBI大鼠的耳蜗形态及听功能会进一步改善，尚需要观察更长的时间，以便更好地观察DBI导致耳蜗损伤的动态变化，进一步分析其可能机制。

本研究综合应用三种听力学检测方法对DBI动物的听功能进行了评估，其中ABR是评估2～4 kHz听功能的重要方法[12]，而40 Hz AERP主要用来检测0.5、1 kHz听功能变化，ASSR具有多频性，故应用ASSR分别检测1、2、4 kHz的听力变化，综合分析三种测试结果，可见三种方法对于DBI大鼠听功能变化的检测具有一致性，可以较全面反映DBI导致耳蜗损伤后不同频率的听功能变化，从而有助于分析耳蜗损伤部位及程度。

总之，DBI可以导致耳蜗损伤，如何准确评估DBI对内耳造成的损伤程度，需联合应用多种检测方法进行综合分析，以便更准确的评估不同频率听功能及耳蜗形态学变化。针对DBI后内耳形态学及听功能损伤的动态变化还有待于进一步延长观察时程，同时还有待于应用分子生物学等实验方法进一步验证弥漫性脑外伤致内耳损伤的分子机制及防治方法。

4 参考文献

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5 Schabitz W R, Berger C, Kollmar R, et al. Effect of brain derived neurotrophic fact or treatment and forced arm use on functional motor recovery after small cortical ischemia [J].Stroke, 2004, 35:992.

6 Tokui N, Suzuki H, Udaka T, et al. Delayed- onset auditory temporary threshold shift following head blow in guinea pigs[J]. Hear Res,2005, 199:111.

7 Liu CL, Chen S, Dietrich D, et al. Changes in autophagy after traumatic brain injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2008,28:674.

8 王文利,路虹,张颖,等.脑震荡前后大鼠听力及耳蜗形态学变化[J].中国耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2007,14:531.

9 Modla S, Czymmek KJ. Correlative microscopy: a powerful tool for exploring neurological cells and tissues[J]. Micron,2011,42:773.

10 Johanson C, Stopa E, Baird A, et al. Traumatic brain injury and recovery mechanisms: peptide modulation of periventricular neurogenic regions by the choroid plexus-CSF nexus[J]. J Neural Transm,2011,118:115.

11 Finnie JW. Comparative approach to understanding traumatic injury in the immature, postnatal brain of domestic animals[J].Aust Vet J,2012 ,90:301.

12 Nölle C, Todt I, Seidl RO, et al. Pathophysiological changes of the central auditory pathway after blunt trauma of the head[J]. J Neurotrauma，2004,21:251.