土沉香组织培养外植体消毒方法的研究

汪腾越，周再知，裘珍飞，梁坤南，曾炳山，马华明，黄桂华

土沉香组织培养外植体消毒方法的研究

汪腾越，周再知，裘珍飞，梁坤南，曾炳山，马华明，黄桂华

(中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520)

针对在土沉香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg组织培养过程中外植体的有效消毒方式问题，以1年生土沉香实生苗为材料，开展了茎段外植体次氯酸钠(5%、10%、20%)和升汞(0.05%、0.1%、0.2%)3个浓度水平的消毒试验；在此基础上，开展了外植体(叶片、顶芽和茎段)，次氯酸钠消毒时间(0，3，5 min)和升汞消毒时间(0，3，5 min)的3因素3水平正交L9(34) 组合排列试验。结果表明：茎段外植体采用10%浓度的次氯酸钠、0.1%浓度的升汞消毒，效果较好；茎段较叶片、顶芽的污染率和死亡率低，存活率高，为适宜的外植体。最佳消毒方式为75%的酒精浸泡30 s，0.1%升汞消毒5 min，该方法污染率最低、存活率最高，分别为43.33%、31.67%。

土沉香；组织培养；外植体；消毒方法

土沉香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg，又称土沉香、莞香、女儿香，是瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria多年生常绿阔叶树种，分布于海南、广东、广西、云南、福建、台湾等地[1]。土沉香是我国特有、珍贵的药用植物，茎杆经刀砍、虫蛀、病腐、真菌感染后，形成的树脂为沉香。沉香是传统名贵药材和天然香料，具有镇静、镇痛、止痛和抑制结核杆菌生长等多种功效[2]，经济价值极高，特别是上等沉香。土沉香树形美观、树姿优雅、枝繁叶茂、四季常绿，也是观赏价值颇高的园林绿化树种[3]。

近年来由于人们对沉香的无度索取，致使土沉香天然林遭到严重破坏，加之天然林更新能力弱，国内土沉香野生资源已近枯竭，现仅有零星散生分布，资源现状令人堪忧。土沉香已被列入“国家珍稀濒危三级保护植物”与“国家二级重点保护野生植物”名录[4]。采用组织培养繁殖技术，可以在一定程度上保留母本的优良性状，增加良种的繁育能力和数量。组培技术已经成为保护和繁殖珍贵树种的有效措施之一[5]。从野外采集的外植体一般表面和内部都携带着一定数量的细菌和真菌，为组织培养过程中的主要污染源。有效的消毒方法是组织培养成功的前提和保障。不同树种、部位(器官)以及幼嫩程度的外植体，其有效的消毒方法各不相同。目前，对一些珍稀濒危树种外植体消毒方法的探讨与研究[6-8]逐渐增多，而对土沉香尽管开展了组织培养技术[2,9-12]的研究，但尚未见有关土沉香外植体消毒的专门研究报道。本文针对土沉香不同外植体，开展了次氯酸钠与升汞浓度两种消毒剂消毒浓度、消毒时间试验，旨在筛选出适宜的外植体消毒方法，为土沉香组织培养提供无菌操作保障，为土沉香的无性繁殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料取自中国林业科学研究院热带林业研究所土沉香资源保存圃。在圃中选取生长旺盛、健壮、无病虫害的1年生土沉香苗木，取当年萌生叶片、顶芽和茎段。

1.2 试验设计和方法

1.2.1 外植体的处理

将采下的外植体用洗衣粉水来清洗外植体10 min，流水冲洗30 min。在超净工作台上，用75%的酒精浸泡外植体30 s，无菌水涮洗1次，然后按照试验要求对外植体进行不同消毒剂、不同时间的浸泡消毒，之后用无菌水涮洗3次。把消毒好的外植体置于铺有无菌滤纸的盘中，吸干材料表面的水分。若外植体是叶片，则切掉四周与药液接触的部分，再切成1.0 cm2左右的小块；若外植体是顶芽，则切掉末端与药液接触的部分，再切成3.0 cm左右的小段；若外植体是茎段，则切掉两端与药液接触的部分，再切成2.0 cm左右的小段。接种到MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L的诱导培养基(添加7.5 g/L琼脂、30 g/L蔗糖)，pH值5.8～6.0[9-11]。培养室温度(25±1)℃，光强度3 000 lx，光照时间12 h/d[12]。

1.2.2 单因素试验

消毒剂次氯酸钠与升汞浓度筛选：分别设计3个处理(次氯酸钠浓度：5%、10%、20%，升汞浓度：0.05%、0.1%、0.2%)，每个处理60瓶，每瓶接种1个外植体，试验重复3次，。以当年生的茎段枝条为外植体，每个外植体消毒5 min。30 d之后，统计污染率、死亡率和存活率，筛选出消毒剂次氯酸钠与升汞的适宜消毒浓度。

1.2.3 正交试验

采用3因素、3水平正交试验设计。3因素分别为外植体、10%次氯酸钠浸泡消毒时间和0.1%升汞浸泡消毒时间。试验共设9个处理，按照L9(34)设计排列(表1)，每个处理60瓶，每瓶接种1个外植体，试验重复3次。30 d之后，统计污染率、死亡率和存活率，筛选出外植体消毒的最佳消毒方式。

表1 土沉香外植体消毒L9 (34) 正交试验设计Table 1 Design of orthogonal test L9(34) for disinfection method of explants of Aquilaria sinensis

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel统计污染率、死亡率、存活率及其反正弦变换(公式y = s in)。利用SAS统计分析软件进行方差分析，Duncan法进行多重比较。

二是高校财务制度在执行过程中，会不断产生各种新的执行政策和要求，且许多财务事项均需相关部门协同进行签批。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 次氯酸钠适宜浓度

方差分析结果表明，在污染率、死亡率和存活率指标上，不同次氯酸钠浓度处理之间差异极显著(P<0.001)。5%次氯酸钠浓度处理的污染率最高（表2），达88.33%，随浓度的上升污染率显著下降，但10%与20%浓度处理之间差异不显著（图1）。当次氯酸钠的浓度提高到20%时，污染率虽然得到一定程度的控制，但死亡率却明显上升，从5%次氯酸钠浓度处理的3.33%升至20%浓度处理的11.67%。在存活率指标上，10%次氯酸钠浓度处理的显著的高于其他两个处理，分别比5%和20%次氯酸钠浓度处理提高了13.34% 和5.00 %。可见，10%次氯酸钠浓度为适宜的消毒浓度。

表2 不同浓度的次氯酸钠消毒效果Table 2 Disinfection effects of different concentrations of NaClO

图1 不同浓度次氯酸钠的消毒效果Fig.1 Disinfection effects of different concentrations of NaClO

2.1.2 升汞适宜浓度

在污染率、死亡率和存活率指标上，不同升汞浓度处理之间差异均达到极显著水平(P<0.001)。0.2%升汞浓度处理的死亡率最高，为46.67%（表3），随着浓度的下降死亡率显著下降，但是0.05%与0.1%浓度处理之间差异不显著。图2显示，当升汞的浓度降低到0.05%时，死亡率虽然得到一定程度的控制，但是污染率却明显上升，从0.05%升汞钠浓度处理的33.33%升至0.2%浓度处理的65.00%。0.1%升汞浓度处理的存活率显著高于其他两个处理，分别比0.05%和0.2%升汞浓度处理提高了20.00%和11.67%。由此可见，0.1%升汞浓度为适宜的消毒浓度。

表3 不同浓度的升汞消毒效果Table 3 Disinfection effects of different concentrations of HgCl2

图2 不同浓度升汞的消毒效果Fig.2 Disinfection effects of different concentrations of HgCl2

2.2 正交试验

2.2.1 外植体的消毒效果

不同外植体的污染率和死亡率差异极显著(P<0.001)。叶片的污染率最高（表4），达到72.78%，而茎段的最低，为55.74%，顶芽介于两者之间，但顶芽的死亡率最高，达到36.30%，显著的高于叶片和茎段处理。在存活率指标上，茎段处理显著高于其他两个处理，分别比叶片和顶芽处理提高了22.78%和21.85%。可见，茎段较叶片和顶芽消毒效果好。

表4 不同外植体的消毒效果Table 4 Comparison of disinfection effects of different types of explants

2.2.2 次氯酸钠不同消毒时间的消毒效果

表5 次氯酸钠不同消毒时间消毒效果比较Table 5 Comparison of disinfection effects of different NaClO disinfection time

2.2.3 升汞不同消毒时间的消毒效果

在污染率、死亡率和存活率3个指标上，不同升汞消毒时间处理之间差异均达到极显著水平（P<0.001）。不采用升汞钠消毒的污染率最高（表6），达到87.04%，随着消毒时间的延长，污染率显著下降。升汞消毒5 min处理的污染率最低，为47.59%, 但死亡率亦达到最高。尽管不使用升汞处理的死亡率低，但污染率也高。从存活率指标上看，不使用升汞显著的低于升汞消毒(3 min或5 min)处理。可见，升汞作为外植体消毒的主要消毒剂是必不可少的。

表6 升汞不同消毒时间的消毒效果比较Table 6 Comparison of disinfection effects of different HgCl2 disinfection time

2.2.4 不同处理之间的消毒效果

9个处理之间的污染率、死亡率和存活率差异极显著（P<0.001）。由多重比较（表7）可知，处理1(A1B1C1)的污染率达100.00%，显著高于其它处理，处理7(A3B3C3)最低，为42.22%。处理的3(A1B3C3)和处理5(A2B2C3)的死亡率较高，消毒时间过长导致外植体死亡，尽管处理1(A1B1C1)的死亡率低，但都已被污染，失去了培养意义。在存活率指标上，处理7(A3B1C3)最高、其次为处理9(A3B3C2)，显著的高于其它几个处理。综上所述，处理7的存活率高，污染率与死亡率低，为土沉香外植体消毒的最佳消毒处理，即以土沉香茎段为外植体采用0.1%升汞消毒5 min。

3 结论与讨论

3.1 外植体

木本植物组织培养过程中，如不能有效的降低各环节的污染率，必将直接影响无菌体系的建立，也就意味着组培工艺难以延续。在自然条件下，作为外植体的植物材料，无论外部还是内部都带有很多的细菌和霉菌。为了给外植体提供一个无菌的生长环境，消毒就成为了在植物组织培养过程中一个不可或缺的步骤[13]。选取外植体并对其进行有效的消毒，亦是组织培养首要解决的问题。本试验所选用的3种外植体(叶片、顶芽、茎段枝条)中，茎段的污染率和死亡率较叶片和顶芽的低，而存活率较叶片和顶芽的高。茎段的消毒效果最佳，其次是顶芽，叶片最差。

表7 正交试验9个处理消毒效果的多重比较Table 7 Duncan’s multiple range test of 9 treatments in an orthogonal test

土沉香叶片外植体的污染率和死亡率均较高，存活率低，消毒效果差，或许与消毒试剂接触面较大有关。顶芽是植物最幼嫩的器官组织，所携带的微生物量比其它器官组织相对少，但因其过于幼嫩，又极易被杀死，无法实现同时降低污染率与死亡率的目的。以同一植株的不同器官为外植体，消毒结果不同，还可能与不同部位的外植体其表达基因不同，或是产生不同的生长物质和次生物质，或是带菌情况不同有关[14]。总之，原因较复杂，尚需进一步研究探索。

3.2 消毒剂与消毒时间

不同的植物，在自然条件下生长，所携带的菌也有所不同，所采取的消毒方式也各不相同。因此，消毒方式(即消毒剂的种类、浓度和消毒时间)的选择对于植物组织培养的成败起着至关重要的作用。研究结果表明，土沉香外植体最佳消毒处理为A3B1C3组合，该组合的污染率最低，为43.33%，存活率最高，为31.67%。最优消毒方式为：采用土沉香茎段为外植体，用洗衣粉水清洗外植体10 min，流水冲洗30 min。在超净工作台中，用75%的酒精浸泡30 s，无菌水涮洗1次，0.1%升汞消毒5 min，无菌水涮洗3次。

本试验采用了10%次氯酸钠与0.1%升汞作为消毒剂。两者比较而言，0.1%升汞具有较好的灭菌作用，这可能是因为Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性、酶失活所致[15]。在土沉香外植体消毒时间长短上，最重要的问题就是如何处理污染率、死亡率、存活率之间的关系。当采取相对较长的消毒时间时，可以有效的降低试验材料的污染率，但是外植体被消毒剂损伤，产生次生代谢物，毒害细胞，导致死亡率又随之显著上升；为了降低死亡率，采取了相对较短的消毒时间，随之而来的结果是外植体会因消毒不彻底而导致污染率显著上升。因此，选择一个相对适宜的消毒时间成为了土沉香外植体消毒试验成败的关键。

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Disinfection methods of explants of Aquilaria sinensis in tissue culture

WANG Teng-yue, ZHOU Zai-zhi, QIU Zhen-fei, LIANG Kun-nan, ZENG Bing-shan, MA Hua-ming, HUANG Gui-hua
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

Focused on the issues of explants’ effective disinfection schemes in the tissue culture of Aquilaria sinensis, one-year-old seedings of Aquilaria sinensis in the nursery were used as propagation material.Using stem explants, two disinfection experiments with three concentrations of NaClO (5%, 10% and 20%) and HgCl2(0.05%, 0.1% and 0.2%) were carried out.Based on the result,an orthogonal experiment with L9(34) array of three factors and three levels, namely explants (leaf, terminal bud and stem), NaClO’s disinfection time (0, 3, 5 min) and HgCl2’s disinfection time (0, 3, 5 min), was conducted.The results show the optimal concentration of NaClO and HgCl2was 10% NaClO and 0.1% HgCl2respectively.Compared with the explants of leaf and terminal bud, stem explants were much better for disinfection in view of its lower rate of contamination and mortality and relatively higher survive rate.The optimal disinfection schemes was that the stem explants were immersed in alcohol (75%) for 30 seconds, and then were immersed in HgCl2(0.1%) for 5 minutes with the lowest contamination rate (43.33%) and the highest survive rate (31.67%).

Aquilaria sinensis；tissue culture；explants；disinfection methods

S727.3

A

1673-923X(2012)03-0044-05

2011-11-19

国家林业公益性行业科研专项“热带珍贵树种良种选育和高效培育技术研究”（201204301）

汪腾越(1988—)，女，四川成都人，硕士研究生，主要从事珍贵树种培育研究；E-mail：wangtengyue@yahoo.cn

周再知(1963—)，女，研究员，博士，主要从事热带珍贵树种繁育技术研究；E-mail：zzzhoucn@gmail.com

[本文编校：吴 毅]