木豆叶醇提物对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用

姜保平，刘亚旻，李宗阳，宋 波，潘瑞乐

中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193

抑郁症(depression)是一种高发病、高致残、高复发的精神疾病。临床研究表明抑郁症病人的下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)功能亢进，血中糖皮质激素水平显著升高［1］。而持续高浓度糖皮质激素可以导致淋巴细胞、皮层及海马神经细胞损伤［2］。PC12细胞株为大鼠肾上腺嗜铬细胞克隆化细胞株，分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征，其胞膜上糖皮质激素受体表达丰富［3］。用高浓度的皮质酮诱导PC12细胞损伤，已成为研究抑郁症的一种常用体外模型［4］。

木豆叶为豆科木豆属植物木豆［Cajanus cajan (L.)Millsp.］的干燥叶子。现代研究表明木豆叶主要成分有芪类和黄酮类化合物，具有抗骨质疏松、降血脂、抗老年性痴呆等多种药理活性［5，6］。而木豆叶提取物对皮质酮损伤的PC12细胞的保护作用，国内外未见文献报道。

本研究用高浓度的皮质酮与PC12细胞共同孵育，模拟抑郁症病人的大脑神经元损伤状态，以此观察木豆叶醇提物及不同组分对神经细胞的保护作用，为木豆叶中抗抑郁新药研发提供科学依据。

1 材料

1.1 药材

木豆叶采自广西凤山县，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定为木豆属植物木豆的干燥叶子。

1.2 试剂

大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞(上海细胞库);精制胎牛血清、DMEM高糖培养基(Gibco公司);二甲基亚砜 DMSO、MTT、Corticosterone(Sigma公司); LDH检测试剂盒(STANBIO，USA)。

1.3 仪器

纯水仪(美国Millipore公司);二氧化碳培养箱(NAPCO 6500 TC法国);连续波长酶标仪(美国BIO-TEK)。

2 方法

2.1 样品制备

用80%乙醇回流提取干燥木豆叶3次，每次1 h，合并滤液，减压回收乙醇，即得乙醇浸膏。乙醇浸膏溶解后，与硅胶拌匀，干燥;用索氏提取器提取，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和95%的乙醇洗脱，分别减压浓缩即得石油醚洗脱部位(PEP)、二氯甲烷洗脱部位(DMP)、乙酸乙酯洗脱部位(EAP)和乙醇洗脱部位(EP)。

2.2 PC12细胞培养

PC12细胞液置于15 mL的离心管中，1000 rpm，离心5 min，弃上清液，将细胞用含有5%胎牛血清和10%马血清的高糖DMEM培养基悬浮，分装于25 mL的培养瓶中，置于37℃的二氧化碳培养箱中培养，每2～3 d换液1次。

2.3 PC12细胞皮质酮损伤模型的建立

PC12细胞培养至对数生长期，用含5%胎牛血清、10%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200 kU/L，链霉素100 mg/L，pH 7.4)重悬细胞，调细胞浓度为每毫升1×105个。细胞接种于96孔板中，各孔加入100 μL细胞液，置于37℃、CO2培养箱中贴壁培养2～4 d，待细胞长满孔底后即可用于实验。加入不同浓度的皮质酮(0.01、0.1、1、10、100 μmol/ L)，作用12、24和48 h后，用MTT法检测细胞的活力，利用酶标仪在570 nm处测定各组细胞吸光度A值。以对照组平均吸收值为100%，以各处理组吸收值与对照组的比值计算存活率。

2.4 木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤的PC12细胞存活力影响

将PC12细胞以每毫升约1×105个接种于96孔板(每孔100 μL)，正常培养24 h后加入终浓度100 μmol/L皮质酮损伤PC12细胞48 h，加入不同浓度(12.5，25，50，100，200 μmol/L)的木豆叶醇提物及不同组分作用24 h后，用MTT法检测细胞存活率，在多功能酶标仪上测定570 nm的吸收度值。

2.5 乳酸脱氢酶活性测定

细胞以每孔1×105个接种于24孔中，培养24 h后加入100 μmol/L的皮质酮损伤细胞48 h，加入不同浓度的木豆叶醇提物及不同组分作用24 h后，收集细胞上清液，按照说明书的方法测定LDH活性。

2.6 数据处理

图1 不同浓度皮质酮作用PC12细胞不同时间对存活率的影响Fig.1 The effect of corticosterone of different concentration on PC12 cell survival rate on different time

3 结果

3.1 不同浓度的皮质酮在不同时间对PC12损伤的MTT测定结果

实验结果显示皮质酮对PC12细胞的损伤程度随浓度和时间呈依赖性上升，10 μmol/L和 100 μmol/L浓度的CORT作用PC12细胞12 h时，其细胞存活率分别为94.3%和89.8%，作用24 h后分别下降为92.6%和86.9%，至48 h后，其细胞存活率72.6%和47.5%。详见图1。因此，本研究中采用100 μmol/L CORT作用48 h建立PC12损伤模型。

3.2 木豆叶醇提物对皮质酮诱导PC12细胞形态的影响

形态学结果显示，100 μmol/L的皮质酮与PC12细胞孵育48 h后，细胞形态发生了显著的变化，表现为突起断裂，包膜不完整，胞体膨胀，胞核固缩(详见图2a，2b);再加入不同浓度的木豆叶醇提物对细胞损伤有一定的逆转作用(详见图2c，2d)。

图2 木豆叶粗提物对皮质酮诱导的PC12细胞神经毒性的保护作用形态学观察(×40)Fig.2 Protective effect of alcohol extract of C.cajan on conticosterone-induced lesion in cultured PC12 cells morphological observation(×40)

3.3 木豆叶醇提物及不同组份对皮质酮损伤的PC12细胞存活力影响

MTT结果显示木豆叶醇提物、石油醚洗脱部位和乙酸乙酯洗脱部位在100～12.5 mg/L对皮质酮损伤的细胞表现出明显的保护作用，50 mg/L达到最大值;二氯甲烷部位在50～12.5 mg/L有明显的保护作用;而乙醇部位在200～12.5 mg/L均表现出明显的活性且其活性的大小有明显的剂量依赖关系。然而，高浓度(200 mg/L)的木豆叶醇提物、石油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位对细胞产生明显的毒性作用。详见表1。

表1 木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤PC12细胞的保护作用(n=5)Table 1 Protective effect of the alcohol extract and its fractions from C.cajan on corticosterone-induced lesion in cultured PC12 cells(n=5)

25 0.5526±0.0182 12.5 0.5308±0.0382

3.4 LDH活性的测定

乳酸脱氢酶(LDH)释放法，进一步证实木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤的PC12有细胞保护作用。木豆叶醇提物100～12.5 mg/L、石油醚部位50～12.5 mg/L、二氯甲烷部位50～12.5 mg/L、乙酸乙酯部位50～12.5 mg/L和乙醇部位100～50 mg/L处理24 h，能显著的降低了LDH的释放率，结果见图3。

图3 木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮诱导的PC12细胞LDH释放率的影响(n=5)Fig.3 The effect of the alcohol extract and its fractions from C.cajan on LDH level of corticosterone-induced PC12 cells on different concentrations(n=5)

4 讨论

本研究采用高浓度皮质酮损伤体外培养的PC12细胞，模拟慢性心理应激抑郁时糖皮质激素升高的状态作为抗抑郁药的筛选模型。结果表明，当皮质酮浓度为100 μmol/L，作用48 h，PC12细胞生长状态差，悬浮细胞明显增多，细胞存活率低于正常细胞，可以在一定程度上体现抑郁模型的病理特征。

本研究采用皮质酮损伤的PC12作为筛选模型，以MTT和LDH两种方法检测，研究木豆叶醇提物及不同组分对细胞损伤的保护作用，结果表明在浓度(50 mg/L)各个部位不但能逆转皮质酮对PC12细胞造成的损伤，且能促进细胞的增殖，并且发现醇提物的活性最好。

木豆叶主要含芪类和黄酮类化合物［7，8］。而芪类化合物主要含木豆素、木豆素A、木豆素C等脂溶性成分，黄酮类化合物以木犀草苷、牡荆苷等水溶性成分为主。本研究石油醚洗脱部位、二氯甲烷洗脱部位和乙酸乙酯洗脱部位主要含芪类等脂溶性成分，而乙醇部位以水溶性黄酮为主。近年来研究表明，芪类化合物具有抗骨质疏松、降血脂和改善阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)模型大、小鼠的学习记忆能力和对神经细胞的保护作用［5］，黄酮类化合物还具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗感染、抗抑郁等作用［9，10］。本研究结果也表明木豆叶的芪类和黄酮类可能都对皮质酮损伤的PC12细胞均有保护作用。而醇提物中既含有芪类成分，又含有黄酮类成分，可能由于各有效成分间的协同作用，表现出更好的效果。

1 Barden N.Modulation of glucocorticoid receptor gene expression by antidepressant drugs.Pharmacopsychiatry，1996，29: 1.

2 Huang WC(黄文超)，Li YF(李云峰)，Luo ZP(罗质璞).The protective effect of monoamine transmitters on the cultured PC12 cells lesioned corticosterone.Chin Pharm Bull (中国药理学通报)，2003，19:103-106.

3 Anderson DJ，Michelsohn A.Role of glucocorticoids in the chromaffin-neuron developmental decision.Int J Dev Neurosci，1989，7:475-483.

4 Li YF，Liu YQ，Huang WC，et al.Cytoprotective effect is one of common action pathways for antidepressants.Acta Pharm Sin，2003b，10:996-1000.

5 Ruan CY(阮灿军).The mechanism study of trans-2，4-dimethoxystibene(S3)anti-Alzheimer's disease in animal model.Beijing:Institute of Basic Medical Sciences Chinese A-cademy of Medical Sciences School of Basic Medicine Peking Union Medical College(北京协和医学院基础医学院)，PhD.2009.

6 Huang GY(黄桂英)，Liao XZ(廖雪珍)，Liao HF(廖惠芳)，et al.Studies on Water-soluble Extracts from Cajanus cajan leaf against hypoxic-ischemic brain damage.Tradit Chin Drug Res Clin Pharm(中药新药与临床药理)，2006，17:172-175.

7 Chen DH(陈迪华)，Li HY(李慧颖)，Lin G(林庚).Study on chemical constituents of leaves of Cajanus cajan(L)Millsp.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，1985，16:134-137.

8 Li L(林励)，Xie N(谢宁)，Cheng ZH(程紫骅).Flavonoids from Cajanus cajan L..J Chin Pharm Univ(中国药科大学学报)，1999，30:21-23.

9 Kim HK，Cheon BS，Kim YH，et al.Effects of natural occurring flavonoids on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW264.7 and their structure-activity relationship.Biochem Phannacol，1999，58:759-765.

10 Matsuda H，Morikawa T，Ando S，et al.Structural requirement of flavonoids for nitric oxide produetion inhibitory activity and mechanism of action.Bioorg Med Chem，2003，11:1995-2000.