猴头菌子实体化学成分研究

麻兵继，徐俊蕾，文春南，于海尤，李 文，阮 元，申进文，马进川

1河南农业大学农学院中药材系;2河南农业大学生命科学院微生物系，郑州450002

猴头菌(Hericium erinaceus)因子实体形状酷似猴子的头而得名，在分类学上，猴头菌属于担子菌门、猴头菌科、猴头菌属，是著名的药食兼用真菌。据《中国药用真菌》记载，猴头菌性平，味甘，能利五脏，助消化，滋补，抗癌，治疗神经衰弱。国内已经广泛用于治疗消化不良、胃溃疡、食道癌、胃癌、十二指肠癌、贲门癌等消化系统疾病［1］。近年来国内外学者先后从猴头菌液体发酵菌丝中分离鉴定了erinacines A-R等共24个具有新奇结构的鸟巢烷型二萜(cyathins)［2］。

猴头菌子实体的化学成分文献报导有:脂肪酸、甾体、多糖及 hericenones A-H、erinacerins A和 B、hericenone I、hericene D等酚性化合物［3，4］。文献报导hericenones类化合物在33 μg/mL的浓度下有促进神经生长因子合成的活性［5］。以后的研究一般也把hericenones类化合物作为猴头菌子实体促进神经生长因子合成的活性成分。最近，日本Nakahata研究组发表的文章也表明猴头菌子实体有显著促进神经生长因子合成的活性，但他们的研究结果提出hericenones类化合物不是猴头菌子实体促进神经生长因子合成的活性成分［6］。其理由有两点: (1)hericenones类化合物在猴头菌子实体中的含量很低，相当于每100 μg/mL的猴头菌子实体乙醇提取液中只含有20 ng/mL的hericenone C、4 ng/mL的hericenone D、2 ng/mL的hericenone E，远达不到文献报导的33 μg/mL有效浓度。(2)即使以100 μg/mL的高浓度hericenone C、D、E三个单体化合物刺激人1321N1星形胶质细胞分泌神经生长因子，测定细胞内的神经生长因子mRNA表达量，Nakahata研究组实验也没有发现hericenones类物质有显著促进神经生长因子基因表达的作用。

基于猴头菌子实体有显著的神经生长因子合成活性但活性成分尚不明确的现状，为了尽可能多地发现猴头菌中的次生代谢产物，我们对猴头菌子实体进行了化学成分的研究，为猴头菌这一宝贵真菌资源在今后防治老年性痴呆等疾病方面的深入开发提供一些思路。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

XRC-1型显微熔点仪为四川大学科仪厂生产，温度计未校正;JASCO-20旋光仪;VG AutoSpec-3000质谱仪;核磁共振测定用 Bruker AM-400和Bruker AM-500，TMS为内标。层析材料和薄层层析材料由青岛海洋化工厂生产;Sephadex LH-20为Merck公司产品。麦角甾-5，7，22-三烯-3β-醇和5α，8α-过氧化麦角甾-6，22-二烯-3β-醇对照品由本实验室自制，纯度超过95%。

猴头菌于2009年7月购自郑州调味品市场，标本由河南农业大学申进文教授鉴定为H.erinaceus，标本(200907009)存于河南农业大学农学院中药材系标本室。

1.2 提取与分离

1000 g干燥的猴头菌子实体经粉碎后用10 L甲醇(2×5 L)室温浸泡12 h，过滤，合并提取液减压回收溶剂得到浸膏约90 g。样品经硅胶拌样后上200～300目硅胶柱分离，以氯仿-甲醇系统梯度(100∶0～70∶30)洗脱，每300 mL收集一次。氯仿-甲醇(80∶20)部分经重结晶得到化合物1(1.7 g)。氯仿-甲醇(70∶30)部分经重结晶得到化合物2(2.5 g)。氯仿-甲醇(90∶10)部分经反复柱层析得到化合物3(475 mg)。纯氯仿洗脱部分流份49～69合并后继续上硅胶柱分离，以石油醚-丙酮梯度(100∶10～90∶10)洗脱分别得到化合物4(60 mg)和5(650 mg)。纯氯仿洗脱部分流份12～35合并后继续上硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度(100∶10～80∶20)洗脱分别得到化合物6和7的混合物(810 mg)和8、9和10的混合物。8、9和10的混合物经凝胶Sephadex LH-20纯化(氯仿-甲醇1∶1，v/v)分别得到化合物8(316 mg)、9(120 mg)和10(103 mg)。氯仿洗脱部分流份3-5合并后再以凝胶Sephadex LH-20纯化(氯仿-甲醇1∶1，v/v)得到化合物11(782 mg)。

2 化学结构及鉴定

化合物1 D-赤藓糖醇，C4H10O4，无色方晶(甲醇)，mp.58℃。FAB--MS m/z(%):121［M-1］-(100)。1H NMR(D2O，400 MHz)δ:3.48～3.56 (m，H-2，3)，3.64(d，J=12.0 Hz，H-1，4)。13C NMR (D2O，100 MHz)δ:71.8(C-2，3)，62.5(C-1，4)。以上波谱数据与文献值符合［7］。

化合物2 D-阿拉伯糖醇，C5H12O5，无色方晶(甲醇)，mp.106℃。FAB--MS m/z(%):151［M -1］-(100)。1H NMR(D2O，400 MHz)δ:3.43 (1H，d，J=8.0 Hz)，3.45(1H，d，J=4.0 Hz)，3.53 (1H，s)，3.60(1H，s)，3.69(1H，d，J=4.0 Hz)，3.72(1H，d，J=4.0 Hz)，3.80(1H，m)。13C NMR (D2O，400 MHz)δ:70.8(C-3)，70.4(C-2)，70.2(C-4)，62.9(C-1)，62.9(C-5)。以上波谱数据与文献值符合［7］。

化合物3 1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(2S，4E，8E，2'R)-2-N-(2'-羟基十六烷酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine，C41H77NO8，白色无定型粉末(甲醇)。FAB--MS m/z(%):710［M-1］-(100)。1H NMR (D2O，400 MHz)δ:3.87(2H，m，H-1)，4.09(1H，m，H-2)，2.08(2H，m，H-3)，5.78(1H，m，H-4)，5.74 (1H，m，H-5)，2.04(2H，m，H-6)，2.04(2H，m，H-7)，5.46(1H，m，H-8)，1.97(2H，m，H-10)，1.68 (2H，m，H-11)，1.38(8H，br.s，H-12-15)，0.94(3H，t，6.4Hz，H-16)，1.64(3H，s，H-17)，4.54(1H，m，H-2')，1.32(22H，br.s，H-2'-12')，1.24(2H，m，H-15')，0.94(3H，t，6.4Hz，H-16')，5.10(1H，m，H-1'')，3.34(1H，m，H-2'')，4.44(1H，m，H-3'')，4.40 (1H，m，H-4'')，3.54(1H，m，H-5'')，3.24(2H，m，H-6'')，7.50(1H，s，-NH)。13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:61.4(C-1)，54.4(C-2)，39.8(C-3)，128.6 (C-4)，136(C-5)，34.7(C-6)，32.1(C-7)，123.1 (C-8)，134.6(C-9)，32.7(C-10)，30.1(C-11)，29.9-29.8(C-12-15)，30.0(C-16)，25.4(C-17)，14.1(C-18)，16.1(C-19)，176.4(C-1')，72.4(C-2')，29.7-29.5(C-3'-13')，27.7(C-14')，22.7(C-15')，16.0(C-16')，103.0(C-1'')，76.1(C-2'')，77.0(C-3'')，72.4(C-4'')，77.3(C-5'')，61.0(C-6'')。以上波谱数据与文献值符合［8］。

化合物4 麦角甾-5，7，22-三烯-3β-醇，C28H44O，无色针晶(氯仿)，mp.152～154℃，［α=-129° (c=0.22，CHCl3)，EI-MS m/z(%):396(［M］+，80)，378(21)，271(55)，253(43)，55(100)。与对照品对照一致。

化合物 5 5α，8α-过氧化麦角甾-6，22-二烯-3β-醇，C28H44O3，无色针晶(氯仿)，mp.177～178℃，［α= +20°(c=0.1，氯仿)。EI-MS m/z (%):428(［M］+，10)，410(10)，396(40)，363 (35)，251(85)，55(100)。与对照品一致。

化合物6和7 为一组硬脂酸、油酸的混合物，C18H36O2、C18H34O2，无色油状物。EI-MS m/z(%): 284，282，241，185，171，143，129。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:180.3(COOH)，130.0(C-9)，129.7(C-10)，29.8(C-2)，29.7-22.7(C-3-17)，14.1(C-18)。在质谱中可见两个明显的分子离子峰284和282，在碳谱中可见脂肪酸的羧基碳、末段甲基以及两个双键碳信号，提示是一个饱和脂肪酸与一个不饱和脂肪酸的混合物。以上波谱数据与文献值一致［7］。

化合物8 hericenone F，C35H54O6，淡黄色油状物。FAB+-MS m/z(%):571［M+1］+(100)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:2.0(1H，m，H-3a)，1.91 (1H，m，H-3b)，2.64(2H，dd，J=6.6，6.6 Hz，H-4)，6.55(1H，s，H-6)，10.41(1H，s，CHO)，1.44(3H，s，2-CH3)，5.51(2H，s，7-CH2)，3.88(3H，s，OCH3)，2.82(1H，d，J=13.9 Hz，H-1'a)，2.66(1H，d，J= 13.9 Hz，H-1'b)，6.06(1H，s，H-3')，2.14(3H，s，4'-CH3)1.86(3H，s，H-5')，2.41(2H，d，J=7.3 Hz，H-2'')，1.69(2H，m，H-3'')，1.25(m，H-4''-15'')，0.88(3H，m，H-16'')。13C NMR(CDCl3，100 MHz) δ:76.9(C-2)，30.1(C-3)，16.5(C-4)，109.2(C-4a)，161.9(C-5)，100.8(C-6)，139.7(C-7)，115.8 (C-8)，158.3(C-8a)，24.5(2-CH3)，52.4(C-1')，197.9(C-2')，125.0(C-3')，156.4(C-4')，20.8(4-CH3)，27.8(C-5')，190.4(CHO)，55.6(OCH3)，64.5(7'-CH2)，173.3(C-1'')，34.4(C-2'')，22.7～32.0(C-3''-15'')，14.1(C-16'')。以上波谱数据与文献值一致［10］。

化合物9 hericenone C，C35H54O6，无色油状物。FAB+-MS m/z(%):571［M+1］+(100)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.53(1H，s，H-6)，5.32 (2H，s，H-1-CH2)，10.11(1H，s，CHO)，3.91(3H，s，OCH3)，3.40(2H，d，J=7.3 Hz，H-1')，5.32(1H，d，J=7.3 Hz，H-2')，3.01(2H，s，H-4')，6.09(1H，s，H-6')，1.84(3H，s，H-8')，1.78(3H，s，H-3'-CH3) 2.12(3H，s，H-7'-CH3)，2.33(2H，dd，J=7.7，7.3 Hz，H-2'')，1.61(2H，m，H-3'')，1.25(m，H-4''-17'')，0.88(3H，m，H-18'')。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:199.5(C-5')，193.1(CHO)，173.2(C-1'')，163.5(C-5)，162.9(C-3)，155.5(C-7')，138.7(C-1)，130.3(C-3')，126.3(C-2')，122.8(C-6')，117.3 (C-4)，112.9(C-2)，105.5(C-6)，62.9(C-1-CH2-)，55.9(OCH3)，55.6(C-4')，34.2(C-2'')，27.7(C-8')，21.6(C-1')，20.7(7'-CH3)，16.4(3'-CH3)，22.7～32.0(C-3''-15'')，14.3(C-16'')。以上波谱数据与文献值一致［5］。

化合物10 hericenone E，C37H54O6，无色油状物。FAB+-MS m/z(%):595［M+1］+(100)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.53(1H，s，H-6)，5.32 (2H，s，H-1-CH2)，10.11(1H，s，CHO)，3.91(3H，s，OCH3)，3.40(2H，d，J=7.3 Hz，H-1')，5.32(1H，d，J=7.3 Hz，H-2')，3.01(2H，s，H-4')，6.09(1H，s，H-6')，1.84(3H，s，H-8')，1.78(3H，s，H-3'-CH3) 2.12(3H，s，H-7'-CH3)2.33(2H，dd，J=7.7，7.3 Hz，H-2'')，1.62(2H，m，H-3'')，2.78(m，H-11'')，2.04(4H，m，H-8''，14'')，1.62(4H，m，H-7''，15'')，5.34(4H，m，H-9''，10''，12''，13'')，0.86 (3H，t，H-18'')。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ: 199.5(C-5')，193.1(CHO)，173.1(C-1'')，163.5 (C-5)，162.9(C-3)，155.4(C-7')，138.7(C-1)，130.3(C-3')，130.2，129.9，128.1，127.9(C-9''，10''，12''，13'')126.3(C-2')，122.8(C-6')，117.3 (C-4)，112.9(C-2)，105.6(C-6)，62.9(C-1-CH2)，55.9(OCH3)，55.6(C-4')，34.2(C-2'')，27.7(C-8')，21.6(C-1')，20.6(7'-CH3)，16.4(3'-CH3)，22.7～32.0(C-3''-8''，11''，14''-17'')，14.1(C-18'')。以上波谱数据与文献值一致［5］。

化合物11 hericene A，C35H56O5，无色油状物。FAB+-MS m/z(%):557［M+1］+(100)。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:6.52(1H，s，H-6)，5.32(2H，s，H-7)，10.10(1H，s，CHO)，3.91(3H，s，H-9)，3.34(2H，d，J=7.0 Hz，H-1')，5.17(1H，d，J=7.0 Hz，H-2')，1.97(2H，m，H-4')，2.03(2H，m，H-5')，5.05(1H，m，H-6')，1.63(3H，s，H-8')，1.60(3H，s，H-9')1.77(3H，s，H-10')。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:138.4(C-1)，112.9(C-2)，162.9(C-3)，118.1(C-4)，163.5(C-5)，105.6(C-6)，62.9(C-7)，193.1(C-8)，55.9(C-9)，21.4(C-1')，121.2(C-2')，131.2(C-3')，39.8(C-4')，26.7(C-5')，124.4 (C-6')，135.7(C-7')，26.7(C-8')，17.6(C-9')， 16.1(C-10')，173.2(C-1'')，34.2(C-2'')，25.1～32.0(C-3''-15'')，14.1(C-16'')。以上波谱数据与文献值一致［11］。

化合物3、8～11的化学结构如图1所示:

图1 化合物3、8～11的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 3 and 8-11

3 讨论

本研究利用柱色谱技术从猴头菌干燥子实体的甲醇提取物中分离得到11个化合物，经光谱技术分别鉴定为:D-赤藓糖醇(1)、D-阿拉伯糖醇(2)、1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(2S，4E，8E，2'R)-2-N-(2'-羟基十六烷酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine(3)、3β-羟基-麦角甾-5，7，22-三烯(4)、3β-羟基-5α，8α-过氧化麦角甾-6，22-二烯(5)、硬脂酸(6)、油酸(7)、hericenone F(8)、hericenone C(9)、hericenone E(10)和hericene A(11)。从次生代谢产物来看，hericenones型酚类物质在猴头菌子实体中含量丰富，四个hericenones类物质的总含量达到子实体干重的0.13%。对于Nakahata研究组提出的hericenones类化合物不是猴头菌子实体促进神经生长因子合成的活性成分的观点，我们认为有值得商榷的地方。我们的研究结果表明，hericenone F和hericene A是猴头菌子实体中含量最高的两个hericenones类化合物。Nakahata研究组以含量较低的hericenone C、hericenone D和hericenone E来测定1321N1星形胶质细胞神经生长因子mRNA表达量，其实验结果不能完全代表整类hericenones化合物的生物活性，hericenones类化合物的构效关系更是缺乏研究。另外，hericenones类化合物水溶性极差，Nakahata研究组在做相关生物活性测试实验时以生理盐水作为溶媒，其真正的药物浓度远达不到文献中所描述的100 μg/mL的高浓度。

虽有鸟巢烷型二萜陆续从猴头菌液体发酵菌丝中报道［12］，但我们在实验中没有从猴头菌子实体中发现此类成分，推测是该类成分的生物合成关键酶在子实体生长过程中没有被激发。另外，我们还从猴头菌子实体中首次分离得到的脑酰胺类物质1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(2S，4E，8E，2'R)-2-N-(2'-羟基十六烷酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine，是一个有意义的发现。近年来的研究表明，脑酰胺类物质有广泛的、重要的生理药理作用［13］，部分脑酰胺类物质很好的神经保护作用，能显著促进神经生长因子合成的生物活性［14］。因此，该类物质也是值得关注的一类生物活性成分，为猴头菌子实体中神经保护作用的活性物质的最终发现提供一种新的可能。

1 Wang XY(王晓玉)，Jiang QY(蒋秋燕)，Ling PX(凌沛学)，et al.Research progress on the effective components of Hericium erinaceus and its pharmacological actions.Chin J Biochem Pharm(中国生化药物杂志)，2010，1:70-72.

2 Shen JW，Ruan Y，Ma BJ.Diterpenoids of Macromycetes.J Basic Microbiol，2009，49:242-255.

3 Ma BJ，Shen JW，Yu HY，et al.Hericenones and erinacines: stimulators of nerve growth factor(NGF)biosynthesis in Hericium erinaceus.Mycology，2010，1(2):92-98.

4 Ma BJ，Yu HY，Shen JW，et al.Cytotoxic aromatic compounds from Hericium erinaceus.J Antibiot，2010，63:713-715.

5 KawagishiH，Ando M，Sakamoto H，et al.Hercenones C，D and E，stimulators of never factor(NGF)-synthesis，from the mushroom Hericium erinaceum.Tetrahedron Lett，1991，32: 4561-4564.

6 Mori K，Obara Y，Hirota M，et al.Nerve growth factor-inducing activity of Hericium erinaceus in 1321N1 human astrocytoma cells.Biol Pharm Bull，2008，31:1727-1732.

7 Yu DQ(于德泉)，Yang JS(杨峻山).Handbook of Analytical Chemistry(Volume VII)-NMR Spectroscopy(分析化学手册(第七分册)-核磁共振波谱分析).Beijing:Chemical Industry Press，1999.

8 Huang Y(黄悦).Chemical Study on four higher fungi and two tropical plants(四种高等真菌和两种热带植物的化学成分研究).Beijing:PhD.Graduate School of Chinese Academy of Sciences，2002.

9 Cong PZ(从浦珠)，Su KM(苏克曼).Handbook of Analytical Chemistry(Volume IX)-Mass Spectrometry(分析化学手册(第九分册)-质谱分析).Beijing:Chemical Industry Press，2000.

10 Kawagishi H，Ando M，Shinba K，et al.Chromans，hericenones F，G and H from the mushroom Hericium erinaceum.Phytochemistry，1993，32:175-178.

11 Alberto A，Rosanna C，Glanluca N，et al.Secondary mold metabolites:part 46.hericenes A-C and erinapyrone C:new metabolites produced by the fungus Hericium erinaceum.J Nat Prod，1995，57:602-606.

12 Ma BJ，Zhou Y，Li LZ，et al.A new cyathane-xyloside from the mycelia of Hericium erinaceum.Z Naturforsch，2008，63b:1241-1242.

13 Zhang AL(张鞍灵)，Liu GQ(刘国强)，Gao JM(高锦明).Chemical structure of cerebroside D.Acta Bot Borea-Occid Sin(西北植物学报)，2001，21:684-688.

14 Qi JH，Ojika M，Sakagami Y.Tetmitomycesphins A-D，novel netritogenic cerebrosides from the edible Chinese mushroom Termitomyces albuminosus.Tetrahedron，2000，56:5835-5841.