丹参酮ⅡA对正常和氧化损伤内皮细胞的保护作用研究

罗 婷，钟先锋，李 静，刘小如，邓泽元

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的前期阶段，血管内膜附有一层内皮细胞，是非常光滑的，动脉粥样硬化发生常伴有内皮细胞损伤或脱落［1］，血管内皮细胞的功能障碍是AS发生的始动因素［2］。故进行早期预防内皮细胞功能障碍对AS的发病具有积极的作用［3］。

丹参酮ⅡA(Tanshinone IIA，TIIA)具有明显的抗氧化应激作用［4］，氧化应激通过产生氧自由基介导血管内皮细胞的损伤，与血管内皮功能障碍有着密切的关系。已有实验证实丹参酮ⅡA具有抗氧化的作用，并且能够抑制羟自由基引起的脂质过氧化［5］。本研究以培养的人脐静脉内皮细胞为材料，观察丹参酮ⅡA对内皮细胞增殖的影响，探讨丹参酮ⅡA保护损伤后的血管内皮细胞和抗动脉粥样硬化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐静脉内皮细胞株(Human vascular endothelial cells，HUVECs)由南昌大学医学院提供;DMEM (Invitrogen corporation);胰蛋白酶(Sigma公司); MTT(Sigma公司);胎牛血清(Gibco公司);丹参酮ⅡA(中国生物制品检定所;批号:110766-200518;纯度:98%以上);DMSO(天津大茂公司);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮合酶(nitrogen oxide synthase，NOS)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)，丙二醛(malondialdehyd，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 仪器与设备

CO2恒温恒湿培养箱(SanYo);生物安全柜(苏净集团安泰公司);倒置显微镜(上海光学仪器进出口有限公司);MK3型酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司);台式冷冻高速离心机(Heal Force)等。

1.3 方法

1.3.1 内皮细胞培养

人脐静脉内皮细胞的培养:取人脐静脉血管内皮细胞接种于50 mL培养瓶内，待细胞铺满80%～90%的瓶底表面积后，用0.25%的胰蛋白酶消化1 min，离心，分装于新的培养瓶中，置37℃、5%的CO2培养箱内培养。第二天换培养液，培养至第3天进行传代。如上述方法正常培养3代以上后，将内皮细胞分组进行实验。

1.3.2 MTT法测定丹参酮ⅡA对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

离心收集对数期细胞，以2×104～5×104个/ mL的密度接种于96孔板中，5%CO2，37℃培养箱中培养24 h后，弃去培养液，用PBS洗去未贴壁细胞。换用无血清的培养基继续培养8 h，使细胞同步化。然后换用含5%胎牛血清和不同浓度丹参酮ⅡA的DMEM培养液培养，其中丹参酮ⅡA分6个浓度，分别是400、200、100、40、20、10 μmol/L，每组设6个复孔，同时设置调零孔和对照孔。24 h后终止培养，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，在37℃体积分数5%CO2孵育4 h。弃去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，并用酶标仪OD490nm处测定各孔的吸光值。

1.3.3 MTT法测定丹参酮ⅡA对人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

将细胞分为对照组(在细胞培养体系中不施加任何干预因素)、H2O2组(在细胞培养体系中加入100 μmol/L的 H2O2)和药物干预组(10～100 μmol/L丹参酮ⅡA+100 μmol/L H2O2)［7］。前期实验操作同1.3.2，加入丹参酮ⅡA后，培养24 h，加入100 μmol/L H2O2作用内皮细胞6 h，换入无血清DMEM培养液100 μL/孔，并于每孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL。继续培养4 h后，加入DMSO使结晶物溶解，并用酶标仪OD490nm处测定各孔的吸光值。

1.3.4 测定丹参酮ⅡA对内皮细胞LDH、SOD、MDA、NOS、NO和GSH的影响

使用试剂盒，按照试剂盒说明书测定每组内皮细胞中LDH释放率，MDA、NOS、NO、SOD和GSHPx的变化。

1.3.5 流式细胞术检测内皮细胞凋亡

实验分组同1.3.2，内皮细胞用胰酶消化后，PBS洗涤2遍，离心(1000 rpm，5 min)获取细胞，加入100 μL的Binding Buffer悬浮细胞，使用5 μL FITC和5 μL PI在室温避光反应10～15 min，离心加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，在1 h内进行流式细胞仪的检测。

1.3.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件处理实验数据，单因素方差分析进行显著性检验，并用LSD-t进行了组间差异性比较;所得数据用±s表示，P＜0.05表示差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮ⅡA对正常内皮细胞生长的影响

如图1所示，低剂量添加丹参酮ⅡA对正常内皮细胞的生长没有影响，但在浓度达到200 μmol/L时，对内皮细胞生长产生抑制作用，可能过量的丹参酮ⅡA会对内皮产生细胞毒性。图1显示，丹参酮ⅡA添加浓度于10～100 μmol/L之间时，内皮细胞的存活率没有明显影响，但当上升到400 μmol/L，内皮细胞的存活率也于100%下降到57.4%，随着丹参酮ⅡA添加浓度的升高，丹参酮ⅡA对血管内皮细胞生长抑制作用越来越明显，呈现浓度依赖关系。

图1 丹参酮ⅡA对内皮细胞增殖的影响Fig.1 The effect of Tanshinone IIA on the proliferation of HUVECs

2.2 丹参酮ⅡA对内皮细胞损伤的保护作用

根据2.1的实验结果，本实验选择了较低浓度(5～100 μmol/L)的丹参酮ⅡA来保护内皮细胞，以排除细胞毒性的影响。从图2可以看到，丹参酮ⅡA对内皮细胞的保护作用显浓度依赖关系。比较药物添加各组和H2O2组，添加5、10 μmol/L的丹参酮ⅡA对内皮细胞的保护作用不明显(P＜0.05)，而添加量上升到20 μmol/L，则有显著的保护作用。

图2 丹参酮ⅡA对内皮细胞损伤的保护作用Fig.2 Protective effects of Tanshinone IIA on HUVECs from oxidative injury

2.3 丹参酮ⅡA对内皮细胞 LDH、SOD、MDA、NOS、NO和GSH的影响

从表1可以看到，H2O2组的LDH释放率和MDA与对照组相比显著上升，LDH释放率从36.28%上升到54.89%，MDA从23.78 nmol/mg prot上升到45.70 nmol/mg prot。加入丹参酮ⅡA处理后，LDH释放率和MDA有不同程度下降，如100 μmol/L丹参酮ⅡA预处理组与H2O2组比较，LDH释放率下降为44.75%，MDA下降为33.57 nmol/mg prot，说明内皮细胞经丹参酮ⅡA预处理，可以抵御氧自由基损伤，降低细胞脂质过氧化物，维护生物膜的完整性。

NOS是维持内皮细胞生理功能的重要活性物质，能清除体内自由基。NO可促进血管舒张，并抑制增生作用［6］。H2O2组与对照组相比，内皮细胞NOS表达减少，其产物NO水平也随之降低，随着丹参酮ⅡA加入，NO水平回升。

细胞内同时存在清除过量氧自由基的系统，如SOD和GSH-Px，这些抗氧化酶可以保护内皮细胞，维持细胞膜结构和正常生理功能的作用。本研究表明:与对照组相比，H2O2组SOD和GSH-Px活性显著降低。与H2O2组相比，50和100μmol/L丹参酮ⅡA均可增强内皮细胞的SOD、GSH-Px活性，SOD活力分别为112.51 U/mgprot和131.37 U/mgprot (P＜0.05);GSH-Px活力分别为176.52 U/mgprot和212.96 U/mgprot(P＜0.05)。且随浓度的增加，细胞的SOD和GSH-Px活性也逐渐提高，表明丹参酮ⅡA可增强内皮细胞的抗氧自由作用，具一定的量效关系。

表1 丹参酮ⅡA对人脐静脉内皮细胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD和GSH-PX的影响Table 1 Effects of Tanshinone IIA on LDH，MDA，NOS，NO，SOD，GSH-PX in HUVECs

2.4 丹参酮ⅡA对内皮细胞凋亡的影响

从图3可以看到，人脐静脉内皮细胞经H2O2氧化损伤后，41.7%的细胞进入早期凋亡，2.1%的细胞进入晚期凋亡或者坏死，而丹参酮ⅡA预处理组(50 μmol/L)，有23.2%的细胞进入早期凋亡，0.6%的细胞进入晚期凋亡或者坏死，提示丹参酮ⅡA可以保护内皮细胞免受氧化损伤，降低细胞凋亡率，维持正常生理功能防止AS的形成。

图3 FITC-PI通道的二维散点图Fig.3 Bivariate graphs illustrate the FITC-PI fluorescent resolution of HUVECs

3 讨论

人体内多种因素导致血管内皮细胞损伤，如炎症因子、失去平衡的调节因子、活性氧、脂肪氧化酶等，其中活性氧产生的氧化损伤是其中重要的因素之一［7］。人体正常生理活动过程伴有氧化性物质参与，主要为氧自由基。氧自由基可以参与人体的物质代谢和信号传导，对细胞发挥正常生理功能起着重要作用。但是人体产生过量氧自由基或者清除能力下降时，则对人体内各种细胞产生不可逆的氧化损伤。

实验室为了建立氧化损伤模型，多采用H2O2、乙醇和ox-LDL等试剂，本研究利用H2O2产生O来建立HUVECs损伤模型，因为该系统经济科学，方便易行，适于快速诱导损伤建立模型，进而大量筛选药物。综合文献和预实验数据分析，本文采用200 μmol/L的H2O2诱导内皮细胞损伤。

从自然界中提取的部分植物化合物对细胞有细胞毒性，在研究各种化合物对细胞的保护作用时，实验设计的药物浓度应在不产生细胞毒性的范围内。在本研究中，当丹参酮ⅡA添加浓度上升到200μmol/L，对HUVECs的增殖产生抑制作用，有显著性差异(图1)。所以本研究的实验方案设计的药物浓度为5～100 μmol/L。

氧自由基损伤细胞膜上的脂质，使其过氧化分解生成脂质过氧化物，如MDA。MDA能与蛋白质、氨基酸及其它细胞成分作用，最终使磷脂结构发生变化，生物膜受到严重的损害，致使细胞活力下降，同时细胞内的LDH外漏［8］。丹参酮ⅡA也促进了NOS和NO的生成量(表1)，为了应对氧化应激，恢复平衡状态，相对正常分泌水平过量产生的NOS和NO能清除体内自由基，维持血管正常生理功能。随着丹参酮ⅡA加入，NO水平回升。丹参酮ⅡA也促进了SOD和GSH-PX的分泌，SOD和GSH-PX是体内清除过量氧自由基的系统，能消除人体在吸收代谢过程中生成的有毒有害物质，如超氧阴离子自由基，体内依靠SOD和GSH-PX系统可以维持细胞内的氧化还原状态的平衡。

研究证实在动脉粥样硬化的斑块中存在着血管内皮细胞的凋亡现象。而且血管内皮细胞位于血管最内层，直接与循环血液接触，因此较易受到血液中活性物质及血液剪切力的影响，在心脑血管疾病的发生过程中处于关键环节［9］。细胞凋亡导致细胞核内的DNA因漏出而减少，加入丹参酮ⅡA预处理后，大大减少了凋亡率，保持了内皮细胞的正常活力和生理功能。

综合上述，丹参酮ⅡA在10～100 μmol/L浓度下，无细胞毒性;加入丹参酮ⅡA预处理后，减弱了因H2O2引起的细胞的过度脂质过氧化，维持细胞膜结构，减少了LDH释放率和MDA生成量，增加了NOS、NO、SOD和GSH等抗氧化物质的分泌量，阻碍了细胞凋亡和在血管表皮上形成动脉粥样硬化斑块，阻止AS的发生和发展。

1 Avriam M.Modified forms of low density lipoprotein and atherosclerosis.Atherosclerosis，1993;98:1-9.

2 Fu H，Li J，Li QX，et al.Protective effect of ligustrazine on accelerated anti-glomerular basement membrane antibody nephritis in rats is based on its antioxidant properties.Eur J Pharmacol，2007:197-202.

3 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the1990s.Nature，1993，362:801-809.

4 Tang F，Wu X，Wang T，et al.Tanshinone II A attenuates atherosclerotic calcification in rat model by inhibition of oxidative stress.Vasc Pharmacol，2007，46:427.

5 Wang L(王兰)，Li XR(李新荣)，Deng XL(邓湘蕾)，et al.The effect of Tanshinone IIA on oxygen free radicals in type diabetes.J Clin Exp Med(临床和实验医学杂志)，2007，6(7):8-11.

6 Song LW(宋良文)，Wang DW(王德文)，Wang TL(王泰龄)，et al.Expression and antagonist role of endothelin and nitric oxide synthase in atherosclerotic plaque.Chin J Pathol (中华病理学杂志)，1997，26:12-15.

7 Csiszar A，Smith KE，Koller A，et al.Regulation of bone morphogenetic protein-2 expression in endothelial cells:role of nuclear factor-kappaB activation by tumor necrosis factor-alpha，H2O2，and high intravascular pressure.Circulation，2005，111:2364-2372.

8 Peng L(彭亮)，Li ZM(李知敏).The protective effect of Spirodela polyrrhiza(L).Schleid extract on ECV-304 injury induced by hydrogen peroxide.Lishizhen Med Mater Med Res (时珍国医国药)，2009，20:996-998.

9 Mei JJ(梅家俊)，Cai DY(蔡大勇)，Zhao TX(赵婷秀)，et al.Study of the effective mechanism which Chinese herb Ligusticum chuanxiong Hort prevents and cures the pathological changes of rabbit atherosclerosis.J Hubei Coll Tradit Chin Med(湖北中医学院学报)，2004，6:5-7.