肉桂抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

许芹永，朱靖博，2*，王振中，肖 伟

1大连工业大学食品学院;2大连工业大学植物资源化学与应用研究所，大连116034;3江苏康缘药业股份有限公司，连云港222001

肉桂为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥树皮，其性味辛、甘、大热，具有补火助阳，引火归源，散寒止痛，活血通经之功效［1］。肉桂的主要成分为桂皮醛、肉桂酸、醋酸苯丙酯、醋酸桂皮酯、肉桂醇、香豆素等。此外，尚含胆碱、β-谷甾醇、原儿茶酸、鞣质、水芹烯、丁香油酚等［2，3］。肉桂中含挥发油1%～2%左右，胥新元等［4］研究表明，肉桂挥发油具有降血糖的作用，故可对肉桂挥发油部分进行进一步的分离纯化，以期获得活性更高的单体化合物。

α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制小肠内α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收，从而有效降低餐后高血糖。由于其独特的优势，α-葡萄糖苷酶抑制剂已被第三次亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物［5］。医学界已将α-葡萄糖苷酶抑制剂列为第3类口服降糖药［6］，如由德国拜耳公司研制的阿卡波糖在临床上已被广泛用于糖尿病及其并发症的防治。但是由于阿卡波糖能够引起某些严重的副作用，以α-葡萄糖苷酶为靶分子，从中药中寻找α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为一个世界性的热点［7-11］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选普遍采用分光光度法作为检测手段，但试剂消耗大，且重现性差，尤其对复杂样品或有颜色干扰的样品，假阳性高［12］。因此，本研究首次利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)结合体外抑制α-葡萄糖苷酶活性筛选模型，从肉桂的石油醚活性部位追踪分离，得到2个具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性单体。

1 仪器与材料

500 MHz AVANCE型核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司;Spectrum One-B型傅立叶变换红外光谱仪，美国铂金埃尔默公司;UltiMate 3000高效液相色谱分析仪，美国DIONEX公司;微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;R502B型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司;HWS-26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司;SK-1型快速混匀器，常州国华仪器有限公司。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20，面包酵母，纯度≥10 U/mg)，sigma公司;对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，PNPG，纯度 99%，sigma公司;对-硝基酚，PNP，分析纯，国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白，BSA，纯度≥95%，sigma公司;阿卡波糖，Acarbose，50 mg/片，拜耳医药保健有限公司;柱色谱和薄层色谱用硅胶，购自青岛海洋化工厂。肉桂于2010年10月购自河北安国中药材市场，经鉴定为Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮。

2 实验方法

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂活性组分的跟踪分离

干燥肉桂2 kg，粉碎后，用石油醚加热回流提取3次，每次3 h，过滤，回收滤液，减压旋转蒸发浓缩至干，得到石油醚提取物(Cp，35.7 g)。利用体外筛选模型，对Cp进行酶活测试，Cp对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，并且高于阳性对照药物阿卡波糖，所以采用活性追踪方式对Cp进行追踪分离。

将Cp经过200～300目硅胶柱色谱，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱(10∶1～1∶1)，得到5个部分，其中第2部分(Cp-2，6.8 g)和第3部分(Cp-3，2.4 g)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性。Cp-2部分经过硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10∶1～7∶3)，得到化合物桂皮醛(2.8 g，1)。Cp-3部分经硅胶柱色谱，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱(10∶0～1∶1)，以TLC检测合并，再经硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯洗脱(9∶1)，石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到化合物肉桂酸(230 mg，2)。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的筛选方法

2.2.1 检测方法

本实验采用高效液相色谱法，反应体系参照朱文佳［13］所建立的体外α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，并在其基础上加以优化改进，按照下式计算抑制率，并用Origin软件求出相应IC50值。

式中，A为不加待测样品的PNP浓度(扣除相应空白，mmol/L);B为加入待测样品后PNP的浓度(扣除相应空白，mmol/L)。

色谱条件:Sino Chrom ODS-BP色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，大连依利特分析仪器有限公司);流动相:A为乙腈，B为含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱条件为:0～8 min，20% ～30%A;8～13 min，30%～80%A;13～18 min，80% ～20%A;18～28 min，20%A);流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL;柱温:常温;检测波长:315 nm。

2.2.2 标准曲线制作

根据采用的反应体系，精确称取0.0209 g PNP标准品，用磷酸盐缓冲溶液，超声溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成6 mmol/L的PNP母液，将其稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025 mmol/L。分别取7个不同浓度的PNP溶液各80 μL，加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL，用超纯水稀释至500 μL，混匀，过0.45 μm滤膜，HPLC检测，检测波长为315 nm。以PNP峰面积为纵坐标，PNP浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

实验在1.5 mL离心管中进行，根据所采用的反应体系(总体积为160 μL):25 μL pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液、5 μL 10 mg/mL待测样品，30 μL 0.1 U/ mL α-葡萄糖苷酶，震荡混匀，37℃孵育20 min，加入20 μL 4.0 mmol/L PNPG开启反应，震荡混匀，37℃反应30 min后，加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3终止反应，加超纯水稀释至500 μL，震荡混匀，经0.45 μm膜过滤后，用HPLC检测，通过产物PNP的浓度变化，计算α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

酶活力单位定义:37℃，pH 6.8条件下，每分钟水解底物所产生1 μmol PNP的酶量，规定为1个酶活力单位(U)［13］。

3 结果与讨论

3.1 结构鉴定

化合物1 黄色油状物，UV λmax(MeOH)nm: 225，289。IR νmax(KBr)cm-1:2926，2740～2854，1679，1626，973，748，689。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.72(1H，dd，J=8.0，16.0 Hz，H-2)，7.42～7.58(6H，m，H-3，5，6，7，8，9)，9.70(1H，d，J= 7.65 Hz，H-1)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:128.5 (C-5，C-9)，128.6(C-7)，129.1(C-6，C-8)，131.2 (C-4)，134.0(C-3)，152.7(C-2)，193.6(C-1)。以上数据与文献［15］报道一致，故确定1为反式桂皮醛。

化合物2 白色粉末，mp.133～134℃。UV λmax(MeOH)nm:223，278。IR νmax(KBr)cm-1:2614～3025，1683，1631，766，705。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.46(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，7.40(3H，m，H-6，7，8)，7.55(2H，m，H-5，9)，7.80(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:117.3 (C-7)，128.4(C-5，C-9)，129.0(C-6，C-8)，130.8 (C-4)，134.1(C-3)，147.1(C-2)，172.2(C-1)。以上数据与文献［15］报道一致，故确定2为反式肉桂酸。

3.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的筛选

从肉桂石油醚提取物Cp中分离得到5个部分，筛选发现第2部分和第3部分为活性部分，从中继续分离得到2个活性化合物。从表1可以看出，2个化合物初筛抑制率均高于阳性对照药物阿卡波糖，而IC50均远小于阿卡波糖，具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

康文艺等［16］利用UV-2000型紫外可见分光光度计在405 nm测得阿卡波糖体外抑制α-葡萄糖糖苷酶活性的IC50值为1081.27 μg/mL。该研究选择的保温时间(15 min)、反应体系总体积(160 μL)、检测仪器和波长(405 nm)等与本研究不同，但阿卡波糖的IC50值很接近，表明本研究利用的筛选模型及检测方法稳定、准确可靠。

表1 不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1 α-Glucosidase inhibitory activity of extracts and compounds of C.cassia

3.3 受试化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

受试化合物不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响如图1所示，2个化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性均与浓度呈正量效关系，即剂量依赖性，抑制活性随着受试化合物质量浓度的提高而增强，并且1的活性稍高于2。

图1 受试化合物质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.1 The mass concentrations of compounds effect on inhibitory activity of α-glucosidase

3.4 受试化合物抑制类型的确定

2个化合物分别取合适的2个不同浓度，PNPG取5个不同浓度，分别测定反应速度。按 Lineweave-Burk作图法，以1/［S］为横坐标，1/V为纵坐标(［S］为底物浓度，V为反应速度)，绘制2个化合物的抑制动力学曲线(图2～3)，得到α-葡萄糖苷酶的Km的值为1.06 mmol/L。

从图2和3可以看出，化合物1和2对α-葡萄糖苷酶抑制作用属于非竞争性抑制，反应速度Vmax随着受试化合物浓度的增大而变小，米氏常数Km保持不变［17］。根据非竞争性抑制动力学方程［16］: 1/V'max=1/Vmax(1+［I］/Ki)，可以求出2个化合物的Ki值分别为178.07 μg/mL和229.43 μg/mL。

4 结论

本研究首次采用以HPLC作为检测手段的α-葡萄糖苷酶抑制活性体外筛选模型，对肉桂石油醚提取物进行活性追踪分离，得到2个活性单体化合物，活性远高于阳性对照药物阿卡波糖。化合物1和2对α-葡萄糖苷酶抑制作用均属于非竞争性抑制类型，说明它们既可以和酶结合，也可以和酶-底物复合物结合，从而降低酶活性，实现降血糖的作用。

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