致病性大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳图谱的建立

张 媛，李 建，彭小兵，刘轶秋，王 楠，李旭妮

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

细菌分型的目的是分析流行病学上相关的菌株是否来源于单一亲代菌株的克隆扩增，区别于流行病学上无关菌株的特征构成了分型的依据[1]。一种理想的分型方法应是高分辨率、可重复性、标准化、快速简便、价格低廉、良好的分型(指某种分型方法对病原体分析可得到阳性结果的能力)，并已成功地用于流行病学调查[1-2]。脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)是一个具有高重复性和高分辨率的细菌分子定型的工具，现已成为分子流行病学研究技术上的“金标准”[3]。1996年，美国疾病控制中心和公众健康实验室协会建立了脉冲网，用于监测食源性微生物。2004年9月，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所牵头，在北京成立了中国脉冲网。该监测网络为跨地区病例的病原分析提供了比较平台，便于快速比对搜寻分子分型上一致或高度相似的型别，从而为发现传播流行和溯源提供线索和提示。中国脉冲网主要收录的是人类病原微生物的脉冲图谱，对于动物病原微生物的流行病学调查许多工作者也在采用PFGE的方法进行研究，但还没有形成规模化的网络。

大肠埃希氏菌病是一类重要的人畜共患病，在国内外均普遍发生，对养猪业危害极其严重，可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病等病型。《中国兽医菌种目录》中收录的致病性大肠埃希氏菌，其背景资料涵盖菌株历史(包括菌株来源、别号、原学名及菌株的分离)，菌株的主要特性(包括菌株的毒性、毒力、抗原性、免疫原性、培养特性、模式株或参考株、血清型等)，菌株的用途(包括用于制造疫苗、检验疫苗等)，参考文献，培养基及生长条件等，但是没有涉及菌株基因分型的数据。本研究利用PFGE方法建立了《中国兽医菌种目录》收录的127株致病性大肠埃希氏菌的电泳图谱，完善了《中国兽医菌种目录》中致病性大肠埃希氏菌背景资料，使其具有更大的参考价值，也为进一步探讨大肠埃希氏菌基因分型与血清学分型及菌株致病性之间的对应关系提供了有意义的数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 致病性大肠埃希氏菌 127株致病性大肠埃希氏菌，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。

1.1.2 质控菌株 大肠杆菌ATCC18785，由中国兽医药品监察所提供。

1.1.3 培养基 普通肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基，由中国兽医药品监察所提供。

1.1.4 试剂 低熔点琼脂糖(Seakem Gold琼脂糖)、蛋白酶 K、限制性内切酶(XbaⅠ酶，10 U/μL)、10 ×H Buffer，购自美国 Promega 公司。三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、十二烷基肌氨酸钠(N-Lauroyl Sarcosine sodium)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自Amresco公司。溴化乙锭储液(EB，10 mg/mL)购自北京鼎国生物技术有限公司。HCl、Na2EDTA·2H2O、NaOH、硼酸，均为国产分析纯。

1.1.5 主要仪器设备 GNP-9270型隔水式恒温培养箱、DKB-8A型电热恒温水槽，购自上海精宏实验设备有限公司。CHEF-DR III型脉冲电泳仪、凝胶成像系统，购自美国Bio-Rad公司。PHSJ-4A型实验室pH计，购自上海雷磁仪器厂。电子天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司。THZ-C型恒温振荡器购自太仓市实验设备厂。紫外分光光度计购自美国Beckman公司。Herasafe KS生物安全柜购自德国Heraeus公司。移液枪购自法国Gilson公司。

1.2 方法

1.2.1 制备细菌悬液 开启菌种，在麦康凯琼脂平皿上划线培养。刮取细菌，悬浊于CSB中。测定610 nm处OD值，调整浓度至1.4～1.5。

1.2.2 制备胶 在调整好菌液浓度的每个试管中加入10 μL蛋白酶K储存液(20 mg/mL)，每个菌液均吸出200 μL加到离心管中，向加有菌液的离心管中加入200 μL已融化的含1%Seakem Gold琼脂糖及1%SDS的TE。混匀后加到模具中，将胶放在室温10～15 min以使其凝固。

1.2.3 裂解胶 每个样品需使用5 mL CLB，每5 mL CLB加入25 μL蛋白酶K储存液(20 mg/mL)，每个试管中均加入5 mL此混合液，将每个样品制备的胶移入相应的试管中，确保胶块在液面下。在54℃摇床中孵育2 h，转速200 r/min，裂解完成立即洗胶。

1.2.4 洗胶 每个管中加15 mL预热的纯水，置50℃摇床中振荡15 min(200 r/min)。将水倒掉，每个管中再加15 mL预热的纯水，置50℃摇床中振荡30 min(200 r/min)。将水倒掉，每个管中加15 mL预热的TE，置50℃摇床中振荡15 min(200 r/min)。再用TE重复洗3次，一共用TE洗4次。将TE倒掉，把胶移到装有2 mL室温TE的试管中，置4℃存放。

1.2.5 酶切 用刀片将胶的边缘裁直后切成4～4.5 mm厚的胶层，将胶层放到装有200 μL 1×H Buffer的离心管中，确保胶层在液面下，置37℃孵育10 min后，将缓冲液吸出。每个管中加入200 μL酶切溶液(174 μL 纯水，20 μL 10 ×H Buffer，4 μL XbaⅠ酶，2 μL BSA)，37 ℃孵育4 h后置4 ℃存放。

1.2.6 加样 将离心管底的缓冲液吸出，加入200 μL 0.5×TBE Buffer，室温孵育5 min后，把胶块加在梳子齿上，室温下风干10 min。把梳子放入胶槽，倒入100 mL融化的54℃ 1%Seakem Gold琼脂糖，室温下凝固30 min。移走梳子，在胶孔中倒入融化的54℃ 1%Seakem Gold琼脂糖，凝固5 min。

1.2.7 电泳 0.5×TBE Buffer制冷至14℃，取出凝固好的胶放入电泳槽，设置电泳条件为:角度120°，脉冲切换时间为2.2～54.2 s，电泳时间19 h，电压6 V/cm，温度14℃。

1.2.8 染色、脱色、拍照 400 mL纯水中加入25 μL EB(10 mg/mL)对胶块震荡染色30 min(40 r/min)，再用400 mL纯水震荡脱色30 min，再重复脱色1次，拍摄图像。

1.2.9 分析 将结果用Bio-Rad公司的Info Quest FP聚类分析软件进行分析。

2 结果

2.1 127株致病性大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳图谱的建立 图1为部分大肠埃希氏菌经PFGE分离，EB染色后的图谱。图1中大肠埃希氏菌的背景信息如表1所示。用Info Quest FP分析软件对电泳结果进行分析，用10～3000 Kb的标尺表示出每株大肠埃希氏菌DNA条带的位置，部分大肠埃希氏菌软件分析结果见图2。将分析结果输入《中国兽医菌种目录》相应菌株的背景资料中，部分大肠埃希氏菌目录如图3所示。

图1 部分大肠埃希氏菌的PFGE结果

表1 部分致病性大肠埃希氏菌背景信息

图3 部分大肠埃希氏菌目录

2.2 127株致病性大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳结果分析 用聚类分析软件对127株大肠埃希氏菌电泳结果进行分析，分析结果以百分比率的形式展示出来，百分比越大说明不同菌株之间的亲缘关系越近;反之亲缘关系越远。Tenover等[4]认为由于细菌具有变异性，在PFGE图谱分析中相似率在85%以上的菌株可以判断是流行病学相关。从表2可以看出，流行病学相关的致病性大肠埃希氏菌O抗原、K抗原、H抗原血清型均相同;采样部位相同;致病性相同。但O抗原、K抗原血清型均相同的大肠埃希氏菌流行病学不一定相关，如从西宁分离的CVCC227和江苏农科院送藏的CVCC226血清型均为O8∶K87，K88ac，但PFGE电泳图谱相似率只有75.8%。血清型不同的大肠埃希氏菌流行病学不相关。

表2 流行病学相关的致病性大肠杆菌比较

3 讨论

《中国兽医菌种目录》对兽医科研工作者、教学人员和有关工厂的技术人员在选择利用微生物资源时有直接助益，对国际间交流起着桥梁作用。目前《中国兽医菌种目录》收录的致病性大肠埃希氏菌背景资料中已经提供了菌株的血清学分型结果，但缺少基因分型数据。本课题组将127株致病性大肠埃希氏菌的条带分子大小补充进《中国兽医菌种目录》相应菌株的背景资料中，使其具有更大的参考价值。

曾对15种O抗原血清型的健康猪大肠埃希氏菌分离株与其相同血清型的大肠埃希氏菌致病株的脉冲场凝胶电泳图谱进行聚类分析，结果表明任何相同血清型的健康猪大肠埃希氏菌分离株和大肠埃希氏菌致病株没有流行病学相关性。这个结果提示，大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳图谱很可能与其致病性有关[5]。

大肠埃希氏菌O抗原血清型鉴定在诊断和流行病学调查中被广泛应用。本研究对127株致病性大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳图谱聚类分析结果表明，O抗原血清型相同的菌株流行病学不一定相关，但流行病学相关的菌株O抗原血清型一定相同。这个结果一方面说明了基因分型比表型分型更细致，同一表型的菌株又可划分为不同的基因型;另一方面也在提示大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳图谱与致病性之间的相关性。大肠埃希氏菌的致病性除与O抗原有一定关系外，主要还取决于K抗原。K抗原是菌体表面的一种热不稳定性抗原，多存在于被膜或荚膜中，个别位于菌毛中。致病性大肠埃希氏菌除含酸性多糖K抗原外，还含有蛋白质粘附素抗原，粘附素是大肠埃希氏菌致病的主要毒力因子[6]。但致病性不是决定脉冲场凝胶电泳图谱的唯一因素，因为研究结果表明O抗原、K抗原血清型及致病性均相同的大肠埃希氏菌流行病学不一定相关。

本研究127株大肠埃希氏菌脉冲场凝胶电泳图谱收录于《中国兽医菌种目录》中，可供研究者进行比对，尽管不能像脉冲网中的数据进行电子比对，但康梅等[7]提供了一个人工比对的标准，即酶切图谱差异3个条带以上者为不同类型，3个条带及以下者为同一型的不同亚型。认为同一型的各亚型间在基因上有相关性，而不同类型的菌株在流行病学上无相关性。如果分离株与《中国兽医菌种目录》中收录的菌株为同一型，可能具有相同的致病性。实验室间进行图谱的比对必须保证使用相同的方法、试剂、仪器及电泳条件。

[1]Robert C，Aber M D，Donald C，et al.Epidemiologic typing of nosocomial microoganism[J].Am J Med，1981，70:899-905.

[2]Joel N Maslow，Maury Ellis Mulligan，Robert D Arbeit.Molecular epidemiology:application of contemporary techniques to the typing of microorganisms[J].Clin Infect Dis，1993，17:153-164.

[3]Pfaller M A，Wendt C，Hollis R J，et al.Comparative evaluation of an automated ribotyping system versus pulsed-field gel electrophoresis for epidemiological typing of clinical isolates of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa from patients with recurrent gram-negative bacteremia[J].Diagn Microbiol Infect Dis，1996，25:1-8.

[4]Fred C Tenover，Robert D Arbeit，Richard V Goering，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing[J].Journal of Clinical Microbiology，1995，33(9):2233-2239.

[5]张 媛.规模化猪场80株大肠杆菌的耐药性、血清型与脉冲场电泳分型[D].北京:中国农业大学，2011.

[6]De Graaf F K，Klemm P，Gaastra W.Purification，characterization，and partial covalent structure of Escherichia coli adhesive antigen K99[J].Infect Immun，1990，58:1858-1870.

[7]康 梅，申艳娜.脉冲场凝胶电泳在医院内感染大肠杆菌的分子流行病学的应用研究[J].华西医学，2002，17(1):34-35.