犬干扰素α制备工艺的优化

殷玉和，李莹莹，刘新涛，吴丛梅

(长春工业大学化学与生命科学学院，长春 130012)

犬干扰素α(CaIFN-α)具有广谱抗病毒活性，可治疗犬细小病毒病、犬瘟热等高致死性病毒病[1]。2009年陈红英等[2]利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增了犬干扰素α全基因，并对该基因进行了克隆和测序。2010年项黎丽等[3]克隆、表达了 CaIFN-α，目的蛋白表达量约为20%。目前还没有关于CaIFN-α大规模生产工艺的系统性研究报道。本文对CaIFN-α序列进行了密码子优化，并设计合成编码CaIFN-α的基因片段，着重对CaIFN-α包涵体的破碎，CaIFN-α蛋白的变性、复性及纯化的方法进行了研究，从而优化CaIFN-α大规模生产工艺。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌E．coli BL21和表达载体pBV220均为本实验室保存;限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ为英国NEB公司产品;琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒为德国QIAGEN公司产品;MDCK(犬肾细胞)、VSV(水疱性口炎)病毒为实验室保存;AKTA explorer100蛋白纯化系统(GE Healthcare);发酵罐(BioFlo5000)。

1.2 方法

1.2.1 CaIFN-α基因片段的合成 参照Genbank中CaIFN-α基因序列，使用Codon Usage Database分析大肠杆菌使用密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，替换了除构成mRNA二级结构密码子外的利用率低于15%的密码子，对密码子进行了优化，设计EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，并由上海生物工程有限公司合成，得到优化的CaIFN-α基因片段。

1.2.2 构建pBV220-CaIFN-α重组表达质粒将pBV220温度诱导型表达载体，用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，切下表达载体片段进行胶回收，用T4连接酶连接合成的CaIFN-α基因片段与pBV220表达载体，构建 pBV220-CaIFN-α重组质粒，经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定，证实构建正确。

1.2.3 重组质粒pBV220-CaIFN-α的诱导表达将重组质粒pBV220-CaIFN-α转化表达菌E．coli BL21，按1%接种量将E．coli BL21工程菌接种于200 mL含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB培养液中，30℃振荡培养过夜。将培养物按5%接种量接种于1 L含氨苄青霉素(50 μg/mL)LB培养液中，30℃培养。至 OD600=0.6时，将二代培养物按10%接种量接种于40 L发酵罐中，30℃培养，至OD600=1～2时，快速升温至42℃，菌体表达，过程中适量添加补料(30%葡萄糖)，控制pH值为7，培养5 h，4000 r/min离心30 min，收集表达菌体，用SDS-PAGE检测表达结果。

1.2.4 CaIFN-α包涵体的制备 将发酵收集菌体按1∶10悬浮于TE缓冲液中，冰浴条件下超声破碎30 min(超声仪频率20 kHz，超声5 s，间隔5 s)，镜检，菌体破碎率90%停止破碎，10000 r/min离心15 min，弃上清，即得CaIFN-α包涵体粗品。

1.2.5 CaIFN-α包涵体的洗涤、变性及复性 将CaIFN-α包涵体粗品按1∶5悬浮于4 mol/L尿素(pH=8.5)中，吹打均匀，10000 r/min离心15 min，弃上清，收集沉淀;将沉淀按1∶5溶于7 mol/L盐酸胍(pH=11)中，混合均匀，裂解作用2～3 h，10000 r/min离心15 min，收集上清，得 CaIFN-α包涵体的溶解液;将包涵体溶解液用2.5 mol/L盐酸胍(pH=11)按1∶3稀释后，按1∶8加入到0.15 mol/L硼酸溶液(pH=9.6)中，4℃复性作用18 h后，得到复性液。

1.2.6 CaIFN-α目的蛋白疏水层析 在复性液中加入(NH4)2SO4至终浓度为1.5 mol/L，上载疏水层析(HIC)柱，柱料为 Phenyl Sepharose 6FF(LS)，平衡液为50 mmol/L PB、1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)，洗脱液为 50 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)，利用AKTA蛋白纯化系统控制，收集洗脱蛋白样品。样品进行SDSPAGE纯度检测，Lowry法测定蛋白浓度，鲎试剂检测内毒素。再生液为0.5 mol/L NaOH，再生色谱柱。

1.2.7 CaIFN-α目的蛋白分子筛层析 将上述收集样品上载分子筛层析(Sephacryl-S-100)，洗脱液为20 mmol/L PB、0.85%NaCl(pH 7.4)，利用AKTA蛋白纯化系统控制，收集洗脱蛋白样品。样品进行SDS-PAGE纯度检测，Lowry法测定目的蛋白浓度，鲎试剂检测内毒素。再生液为0.1 mol/L NaOH，再生色谱柱。

1.2.8 CaIFN-α活性测定 采用细胞病变抑制法[4-5]，依据抑制 VSV(水疱性口炎)病毒攻击MDCK(犬肾细胞)细胞病变的方法，测定重组犬干扰素的活性。将MDCK接种于96孔板，5%CO2、37℃培养为单层，加倍比稀释的重组犬干扰素作用24 h，每孔再加入含100 TCID50的VSV病毒，设计标准品对照和空白对照组，24 h后用结晶紫染液染色细胞，酶标仪上检测测定波长为570 nm，参比波长为630 nm，经SOFT max PRO软件分析输入稀释倍数后，以标准品校正生物活性值。

1.2.9 制备三批CaIFN-α蛋白 按上述工艺制备三批CaIFN-α蛋白，记录不同批次CaIFN-α蛋白的质量检测数据。

2 结果

2.1 CaIFN-α目的基因片段的合成 经密码子优化得到的CaIFN-α基因，由上海生物工程有限公司合成。琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察鉴定，结果如图1所示。由图1可见，CaIFN-α基因大小约为510 bp，与理论大小相符。

2.2 pBV220-CaIFN-α重组质粒的酶切鉴定pBV220-CaIFN-α重组质粒经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，有明显的pBV220表达载体条带和CaIFN-α基因条带，说明pBV220-CaIFN-α重组质粒构建成功，结果如图2所示。

2.3 pBV220-CaIFN-α重组质粒诱导表达结果鉴定 诱导条件:30℃培养，升温42℃诱导。诱导后每隔1 h取样1次，经SDS-PAGE检测，结果如图3所示，诱导后在18000处出现明显CaIFN-α蛋白条带，说明重组质粒有表达。随诱导时间增加，CaIFN-α蛋白表达量增大，诱导5 h CaIFN-α蛋白表达效果最佳，蛋白表达量(目的蛋白与总蛋白的百分比)为25%。

2.4 pBV220-CaIFN-α包涵体破碎、变性及复性表达菌体经过超声破碎得到包涵体，再经7 mol/L盐酸胍变性和0.15 mol/L硼酸复性作用后，可得到初步纯化的CaIFN-α蛋白。复性后CaIFN-α蛋白SDS-PAGE鉴定结果如图4所示，在18000处出现明显CaIFN-α蛋白条带。

2.5 CaIFN-α目的蛋白疏水层析 样品用50 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.8)洗脱液，经疏水层析柱纯化，图5为AKTA蛋白纯化系统紫外检测记录，洗脱峰为CaIFN-α蛋白峰。图6为疏水层析纯化后样品的SDS-PAGE检测结果，在相对分子质量18000处出现一条明显的特异性蛋白条带。

2.6 CaIFN-α目的蛋白分子筛层析 收集的洗脱样品用20 mmol/L PB、0.85%NaCl(pH 7.4)洗脱液，经分子筛层析柱纯化，图7为AKTA蛋白纯化系统紫外检测记录，洗脱峰为CaIFN-α蛋白峰，纯度较高。图8为分子筛层析纯化后样品的SDS-PAGE检测结果，在相对分子质量18000处出现一条明显的特异性蛋白条带，且几乎没有其他杂蛋白条带。

2.7 制备工艺各步骤质量检测 表1中显示为包涵体复性、疏水层析和分子筛层析三个纯化步骤的质量检测数据，总产率为20%。

2.8 不同批次制备CaIFN-α的质量检测 如表2所示，制备的三批CaIFN-α质量检测结果表明，CaIFN-α纯度均≥96%，产率均≥20%，内毒素均≤10 EU/mg，且都具有较好的生物活性，说明本制备工艺稳定性好，可重复性高。

图7 分子筛层析的紫外检测

图8 CaIFN-α纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱

表1 不同纯化步骤质量检测

表2 不同批次CaIFN-α的质量检测

3 讨论

本研究使用Codon Usage Database对大肠杆菌的密码子偏好性进行了分析[6-7]，在不改变氨基酸序列的前提下，将低利用率的稀有密码子替换为表达菌常用的密码子，对CaIFN-α基因进行了优化改造，提高了CaIFN-α基因的表达水平。选择将CaIFN-α基因与pBV220温控型原核高效表达载体[8]连接构建重组质粒，转化表达菌E．coli BL21，培养时间为4 h，升温诱导表达时间为5 h，整个发酵培养周期较短，且表达体系具有抗污染能力强的特点[9]。

由于疏水层析介质具有疏水性弱的特点[10]，并以高盐的水溶液作为流动相，使得与蛋白质的作用过程比较温和。CaIFN-α蛋白以包涵体形式存在，具有较强的疏水性，所以本研究选用疏水层析的方法进行纯化，可以更好保持CaIFN-α蛋白的天然结构和生物活性。疏水层析纯化的CaIFN-α样品上载分子筛层析柱进一步纯化，可以实现更替CaIFN-α样品缓冲液的目的。分子筛层析纯化得到的CaIFN-α样品缓冲液为对动物体无害的磷酸盐体系，便于目的CaIFN-α蛋白的进一步制剂应用。

采用上述生产工艺制备了三批CaIFN-α蛋白，计算其总产率均≥20%，目前所报道的CaIFN-α产率为13.75%[11]，与之相比产率有所提高。工艺中采用常规蛋白质色谱分离方法和常见的无机盐试剂，使得制备过程简单易行且更为安全。质量检测结果表明该CaIFN-α生产工艺适合大规模生产，且具有收率高、稳定性好的特点。

[1]刘宇鹏，吴 琼，任晓慧，等.兽用干扰素的研究进展[J].现代农业科技，2007，(11):131-132.

[2]陈红英，董海聚，崔保安，等.藏獒犬α干扰素全基因的克隆与序列分析[J].安徽农业大学学报，2009，36(1):124-127.

[3]项黎丽，闫若潜，盛 敏，等.犬α干扰素的克隆、表达及纯化[J].中国动物检疫，2010，27(1):35-38.

[4]吴艳花，汪 明，吴志光.德国牧羊犬γ干扰素基因克隆表达与抗病毒活性测定[J].中国兽医杂志，2008，44(6):3-5.

[5]陈忠广，张桂红，夏春丽，等.犬干扰素-γ的稀释复性及活力测定[J].东北农业大学学报，2008，39(9):82-86.

[6]王 侃，刘次全，曹 槐，等.大肠杆菌mRNA编码区长度、形成二级结构倾向与密码子偏好性的关系[J].微生物学报，2006，46(6):895-899.

[7]周红梅，陈 哲，蔡兆伟，等.秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建[J].江苏农业科学，2010，(6):27-31.

[8]陈金中，薛京伦.载体学与基因操作[M].北京:科学出版社，2007:54-69.

[9]屈 伸，刘志国.分子生物学实验技术[M].北京:化学工业出版社，2007:190-200.

[10]郭立安，常建华.蛋白质色谱分离技术[M].北京:化学工业出版社，2011:258-259.

[11]任玉莹，范泉水，邱 薇，等.基因工程犬干扰素α的制备及纯化工艺[J].生物技术通讯，2009，20(1):47-49.