白藜芦醇对人肾细胞癌786－0细胞PDCD5表达的影响

单中杰，魏金星＊，韩前河，侯箐岚

（1.郑州大学第一附属医院 泌尿外科，河南 郑州450052；2.郑州人民医院 泌尿外科，河南 郑州450003）

白藜芦醇是从葡萄、花生、虎杖等药用植物中提取的一种酚类化合物。近来研究［1］发现RES有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化、神经保护等作用。深入研究［2，3］发现其具有抗肿瘤作用，可显著抑制前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌、垂体腺瘤等多种肿瘤细胞的生长。人程序化死亡分子5（the human programmed cell death 5，PDCD5）基因是由北京大学疾病研究中心在国际上首先从人白血病细胞株株TF－1细胞中克隆得到的凋亡相关新基因［5］。PDCD5在人体50多种组织中表达并参与细胞凋亡过程的调控［4－7］。体外实验表明，PDCD5可促使多种肿瘤细胞凋亡，且对放、化疗有协同作用。研究表明［8－11］PDCD5在撤除细胞因子、撤除血清、化疗药物处理等诱导因素，能显著抑制多种癌细胞在体外的生长，明显促进其凋亡。有关白藜芦醇上调PDCD5的表达来诱导肾细胞癌细胞凋亡的研究，至今国内外未见文献报道。本实验旨在探讨RES对人肾细胞癌细胞株786－0体外生长的影响及可能机制，为其用于肾细胞癌的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肾细胞癌细胞株786－0，中科院上海细胞生物学研究所。

1.1.2 主要试剂和仪器 白藜芦醇（纯度为99%）购自美国Sigma公司；二甲基亚砜，Sigma公司；流式细胞仪，德国Partec公司；DMEM培养液，美国HyClone公司；胎牛血清，北京中杉生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞用含有20%胎牛血清，1×105U／L青霉素、链霉素的DMEM高糖培养液在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。

1.2.2 免疫细胞化学检测PDCD5蛋白表达情况取对数生长期的人肾细胞癌786－0细胞，调整细胞密度为1×105个／ml，接种于24孔板中（每培养孔放置直径4mm×4mm的无菌盖玻片），每孔1 ml，细胞贴壁生长后，吸除培养板中的培养液，按实验分组加入稀释好的含白藜芦醇浓度分别为12.5 μmol／L、25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L 的培养液，空白对照组加入同体积的培养液，继续培养，培养24h后取出固定。按照SP试剂盒说明书进行操作。对照组PBS替代一抗作为空白对照。免疫细胞化学检测以细胞浆内有棕色颗粒样物质视为免疫阳性细胞。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 收集对数生长期的细胞，分别用 12.5μmol／L、25μmol／L、50 μmol／L、100μmol／L的白藜芦醇，处理细胞24h，并设空白对照组。离心收集，调整细胞浓度为1×106个／ml各取1ml，PBS离心洗涤2次后，弃上清，加终浓度为70%的冰乙醇，置4℃冰箱固定过夜。检测时再用PBS离心洗涤2次后，PI复合染液暗处染色20min后上流式细胞仪检测并分析细胞周期分布。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集对数生长期的细胞，分别用 12.5μmol／L、25μmol／L、50 μmol／L、100μmol／L的白藜芦醇，处理细胞24h，并设空白对照组。离心收集，调整细胞浓度为1×106个／ml各取1ml，PBS离心洗涤2次后，弃上清，PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞（用蒸馏水1：4稀释结合缓冲液），并调整细胞浓度为2－5×105／ml，取195μl细胞悬液，加入5μl Annexin－V－FITC混匀，室温反应10min，PBS洗涤一次，再以190μl稀释的结合缓冲液，加入10μl的120μl／ml PI，用流式细胞仪分析，每个样本收集20×103个细胞荧光信号，采用Cellquest软件分析结果。实验重复3次。

1.2.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行方差分析，计量资料用±s表示；两组均数的比较用t检验（t－test），方差不齐时先进行变量转换。以α＝0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Res作用后人肾细胞癌786－0细胞形态的变化

正常情况下人肾细胞癌786－0细胞生长良好，呈梭形，圆形或多边形，细胞轮廓清晰。不同浓度的Res作用于人肾细胞癌786－0细胞后可见细胞形态缩小、变圆、核固缩、碎裂，细胞内出现颗粒样物质，悬浮细胞增多（图1）。

图1 RES对人肾细胞癌786－0细胞生长的影响（200X）

2.2 Res对人肾细胞癌786－0细胞PDCD5蛋白表达的影响

Res能明显上调人肾细胞癌786－0细胞PDCD5蛋白的表达，4种不同浓度的白藜芦醇作用于人肾细胞癌786－0细胞24h后PDCD5蛋白表达均较空白对照组有所升高，同一时段内随着浓度增加，PDCD5蛋白表达增高，RES组与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），各实验组之间两两相比，12.5μmol／L与25、50、100μmol／L比较，P均＜0.05；但25μmol／L 与50、100μmol／L比较，P均＞0.05（表1、图2）。

表1 白藜芦醇对人肾细胞癌786－0细胞中PDCD5蛋白表达的影响（±s）

表1 白藜芦醇对人肾细胞癌786－0细胞中PDCD5蛋白表达的影响（±s）

注：空白对照组比较，＊P＜0.05；与12.5μmol／L比较，△P＜0.05

Resveratrol μmol／L Action time（t／h）24 48 72 0 1.10±0.19 1.13±0.21 1.42±0.25 12.5 1.43±0.32＊ 1.57±0.14＊ 1.73±0.34＊25 2.90±0.13＊Δ 3.08±0.21＊Δ 3.23±0.21＊Δ 50 3.06±0.11＊Δ 3.18±0.23＊Δ 3.25±0.20＊Δ 100 3.17±0.45＊Δ 3.22±0.48＊Δ 3.30±0.46＊Δ

图2 RES对人肾细胞癌786－0细胞PDCD5的影响（200X）

2.3 Res对人肾细胞癌786－0细胞周期的影响

人肾细胞癌786－0细胞在Res作用24h后，随着浓度的增高G1期及G2期比例显著下降，S期比例明显升高；不同浓度的Res对肾细胞癌细胞均有明显的抑制作用，表现为G1期及G2期细胞比例明显降低，S期比例明显升高。Res各浓度与对照组比较，P均 ＜0.05；12.5μmol／L 与 25、50、100 μmol／L比较，P均＜0.05（表3）；但25μmol／L与50、100μmol／L比较，P均＞0.05（表2）

表2 不同浓度Res对肾细胞癌细胞周期分布的影响（±s%）

表2 不同浓度Res对肾细胞癌细胞周期分布的影响（±s%）

注：空白对照组比较，＊P＜0.05；与12.5μmol／L比较，△P＜0.05

Res浓度（μmol／L） G1期 S期 G2期0 75.23±2.58 13.17±1.36 11.35±2.37 12.5 73.19±3.63＊ 16.48±3.43＊ 10.16±0.25＊25 65.28±3.10＊△ 24.79±3.72＊△ 9.67±0.43＊△50 57.89±4.33＊△ 33.42±3.36＊△ 8.76±0.87＊△100 48.69±5.88＊△ 43.61±1.67＊△ 7.88±0.78＊△

2.4 Res对人肾细胞癌786－0细胞凋亡的影响

FCM检测白藜芦醇作用人肾细胞癌786－0细胞24h后，显著提高人肾细胞癌786－0细胞的凋亡率，与对照组相比，12.5，25，50，100μmol／L白藜芦醇组凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 流式细胞仪检测RES对人肾细胞癌786－0细胞凋亡的影响（24h）

3 讨论

白藜芦醇（Res），属非黄酮类多酚化合物，分子式是C14H12O5，化学结构式是3，5，4’—三羟基—反—二苯乙烯，是植物在受到外来侵害时所产生的一种抗毒素。Res药理作用广泛，现已发现［1］的药理作用包括有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化、神经保护、抗肿瘤活性等。目前已有多项动物试验和体外试验结果［1，3，7，9］表明，Res对某些癌症，如结肠癌、乳腺癌、肺癌等具有一定的抗癌作用，但具体机制还不是很清楚。深入研究［3］发现Res通过抑制细胞增殖，对细胞周期的影响表现出易变性。Res显著抑制食道癌增殖，使细胞G0／G1期细胞比例显著升高，S期比例明显下降，使细胞停止于G1期。Ahmad［12］等发现Res能诱导CDK抑制蛋白 WAF1／p21的表达，使上皮样癌细胞（A431）停顿于S期。

近来研究发现，PDCD5在肝癌［13］、乳腺癌［14］、甲状腺乳头状癌［15］、宫颈癌［16］中表达下降，且与肿瘤的恶性度呈负相关。同时研究表明［8－11］PDCD5在化疗药物处理等诱导因素的作用下，能显著抑制多种癌细胞在体外的生长，明显促进其凋亡。但目前尚未发现Res对人肾细胞癌786－0细胞的生长和PDCD5表达影响的报道。本实验通过不同浓度Res对人肾细胞癌786－0细胞的生长和PDCD5的转录和翻译的影响，观察肾细胞癌细胞的生长、凋亡和PDCD5的蛋白和mRNA的表达情况。本实验结果发现不同浓度的Res作用人肾细胞癌786－0细胞24h，随着RES的浓度增高，凋亡细胞数逐渐增加，而PDCD5蛋白的表达强度明显增高，流式细胞仪检测发现典型凋亡峰，与空白对照组比较，实验组凋亡率显著增高，随着浓度的增加G1期及G2期比例显著下降，S期比例明显升高，将人肾细胞癌786－0细胞阻滞于S期、诱导细胞凋亡。

本研究结果表明，RES能明显抑制体外培养的人肾细胞癌细胞的生长并促使其发生凋亡，且浓度为25μmol／L时，抑制作用最强。其机制可能与RES诱导PDCD5蛋白表达增加有关，但其抑制肾细胞癌的作用及其具体机制仍需进一步深入探讨。

［1］Quincozes－Santos A，Gottfried C.Resveratrol modulates astroglial functions：neuroprotective hypothesis［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1215：72.

［2］Shukla Y，Singh R.Resveratrol and cellular mechanisms of cancer prevention［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1215：1.

［3］Schmitt CA，Heiss EH，Dirsch VM.Effect of resveratrol on endothelial cellfunction：Molecular mechanisms［J］.Biofactors，2010，36（5）：342.

［4］Kim A L，Zhu Y，Zhu H，et al.Resveratml inhibils proliferation of human epidermoid carcinoma A431cells by modulating MEK1 and Ap－1signalling pathways［J］.Exp Dermatol，2006，15（7）：538.

［5］Kuwajerwala N，Cifuentes E，Gautam S，et al.Resveratrol induces prostate cancer cell entry into S Phase and inhities DNA synthesis［J］.cancer Res，2002，62（9）：2488.

［6］Vyas，Asmerom Y，De Leon D D.Resveratrol regulates insulinlike Group factor－Ⅱ in breast cancer celIs［J］.Endocrinology，2005，146（10）：4224.

［7］Golkar L，Ding X Z，Ujiki M B，et al.Resveratrol inhibits pancreatic cancer cell proliferation through transcriptional induction of macrophage inhibitory cytokine－l［J］.Surg Res，2007，138（2）：163.

［8］Bossowska A，Bossowski A，Galar B.Analysis of apoptotic markers Fas／FasL（CD95／CD95L）expression on the lymphocytes in patients with acute coronary syndrome［J］.Kardiol Pol，2007，65（8）：883.

［9］Lin HY，Tang HY，Shih A，Keating T，Cao G，Davis PJ，Davis FB.Thyroid hormone is a MAPK－dependent growth factor for thyroid cancer cells and is anti－apoptotic［J］.Steroids，2007，72（2）：180.

［10］Mukherjee S，Ray D，Lekli I，Bak I，Tosaki A，Das DK.Effects of Longevinex（modified resveratrol）on cardioprotection and its mechanisms of action［J］.Can JPhysiol Pharmacol，2010，88（11）：1017.

［11］Szumio J.Natural compounds in chemoprevention of esophageal squamous cell tumors－experimental studies［J］.Pol Merkur Lekarski，2009，26（152）：156.

［12］Ahmad N，Adham i VM，A faq F，et al.Resveratrol causes WAF－1＼p21－mediateG（1）－phase arrest of cell cycle and induction of apopto－sis in human an epidemoid carcinoma A 431cells［J］.Clin Cancer Res，2001，7（5）：1466.

［13］Xu XR，Huang J，Xu ZG，et al.Insight into heap to cellular carci no－genesis at transcription level by comparing gene expression profiles of heap to cellular carcinoma with those of corresponding non cancerous liver［J］.Proc N atl A cad Sci USA，2001，98（26）：15089.

［14］H edenfalk I，Duggan D，Chen Y，et al.Gene－expression profiles in hereditary breast cancer［J］.N Eng l JM ed，2001，344（8）：539.

［15］杜 颖，洪天配.TF21细胞凋亡相关基因19与甲状腺肿瘤之间关系的初步探讨［J］.中华内科杂志，2003，42（7）：492.

［16］刘朝晖，张 岱，李克敏，等.PDCD5蛋白在正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌中的表达［J］.北京大学学报（医学版），2004，36（4）：407.