骨肽对成骨细胞成骨功能表达的影响

王维刚，王志刚，李大鹏

（吉林医药学院 附属465医院，吉林 吉林132013）

骨肽具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖、促进新骨形成等药理作用，多用于骨折和骨折手术愈合及风湿、类风湿关节炎的治疗［1］。碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OC）是成骨细胞分泌的两种非胶原成分。活性成骨细胞在早期发育阶段细胞内就富含ALP，后期成熟阶段成骨细胞可产生和分泌骨钙素［2］，因此ALP和OC不仅是成骨细胞生长和发育早期和晚期的表型标志，同时是成骨细胞的功能状态的体现，是骨形成指标。

本实验研究骨肽对体外培养成骨细胞中ALP和OC表达的影响，探讨骨肽在成骨细胞成骨功能中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD乳鼠购自吉林大学动物实验中心。

1.2 主要试剂 DMEM－H培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；骨肽（黑龙江江世药业有限公司）OC放射免疫试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 颅盖骨分离成骨细胞 取1－3d龄小鼠乳鼠20只，无菌条件下取出颅盖骨，PBS液清洗，置入含有DMEM培养基的培养皿中，剪成碎块，0.25%胰蛋白酶中消化30min，37℃；血清终止消化，1.0g／LⅠ型胶原酶消化1h，37℃，2次，冷PBS终止消化，吸取上清液，1 000r／min离心8min，培养液冲洗细胞，以1×106密度将细胞悬液种植于10%小牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。

1.3.2 骨肽对成骨细胞作用 骨肽按照浓度分为0.002mg／ml、0.008mg／ml、0.032mg／ml分为三个剂量，对照组加入基础培养基。分别在1d、3d、5 d利用生化法检测细胞培养液中ALP的含量。骨肽不同剂量继续作用后10d和15d，利用ELISA试剂盒检测OC含量。

2 结果

与对照组相比（见表1），骨肽浓度为0.002mg／ml时，细胞上清中ALP含量无明显改变。随着骨肽浓度增高，ALP的含量有增高的趋势，0.008mg／ml组各时间点与对照组有统计学差异（P＜0.05）；0.032mg／ml剂量组各时间点与对照组相比时ALP增高更加明显，统计学有显著性差异（P＜0.01）。在10d与15d时间点检测OC含量发现（见表2），与对照组相比0.002mg／ml时，OC含量无明显改变。0.008mg／ml剂量组在两个时间点OC含量与对照组相比有显著增加（P＜0.05）；0.032mg／ml剂量组与对照组相比OC含量在两个时间点有显著性增高，尤其是10d时差异明显（P＜0.01）。

表1 不同剂量、不同时间骨肽对成骨细胞ALP含量的影响（±s）

表1 不同剂量、不同时间骨肽对成骨细胞ALP含量的影响（±s）

＊与对照组相比P＜0.05，ΔP＜0.01

骨肽（mg／ml）ALP in osteoblasts（t／d）1 3 5对照组0.17±0.02 0.18±0.01 0.19±0.02 0.002 0.22±0.01 0.21±0.04 0.21±0.05 0.008 0.38±0.02＊ 0.37±0.03＊ 0.35±0.05＊0.032 0.45±0.02Δ 0.43±0.02Δ 0.43±0.03Δ

表2 不同剂量、不同时间骨肽对成骨细胞OC含量的影响（±s）

表2 不同剂量、不同时间骨肽对成骨细胞OC含量的影响（±s）

＊与对照组相比P＜0.05，ΔP＜0.01

0.002 0.008 0.032 10d 1.12±0.02 1.37±0.01 1.63±0.02＊ 1.71±0.02对照组 骨肽浓度（mg／ml）Δ 15d 1.08±0.01 1.27±0.04 1.44±0.05＊ 1.57±0.03＊

3 讨论

成骨细胞是维持骨重建的主要细胞，它来源于骨髓间充质干细胞，功能是分泌骨基质，是骨形成过程中重要的功能细胞。在骨折愈合和骨缺损性疾病中，动员成骨细胞成骨功能，产生骨基质是治疗的关键［3－5］。

骨肽是从中经高科技生物技术精制提取的一种新型骨病治疗药物，内含有多种与骨代谢有关的生长因子及钙、磷等元素，具有广泛的生物学活性，在体内可参与骨钙的吸收和释放，调节骨代谢的平衡，促进骨痂和新血管的形成，因此在临床上广泛应用于骨折和骨折疏松的治疗。

本实验利用骨肽作用于体外培养的成骨细胞，系统研究了不同浓度和不同时间点两种关键的骨形成指标ALP和OC含量的变化，首次研究了骨肽成骨功能的作用特点。结果显示：骨肽浓度在0.002 mg／ml时，各时间点ALP含量变化不明显，考虑与骨肽浓度过低无法启动成骨分化有关。0.008mg／ml和0.032mg／ml两个剂量组，ALP含量表达增高，而且存在剂量依赖关系，证实骨肽浓度达到一定作用水平时可以促进成骨细胞分泌ALP。同时10 d与15d两个时间点，在0.008mg／ml和0.032 mg／ml两个剂量组OC明显增高，也存在剂量依赖关系。虽然15d组在两个浓度剂量OC含量与10 d组相比有下降的趋势，考虑可能与在10d时已经产生足够多的OC，而单纯的依靠时间延长已经无法促进OC的产生，有关这部分的机制需要进一步的研究。

总之，骨肽能促进成骨细胞分泌产生ALP和OC，以中高剂量组促进成骨能力较为显著。

［1］邓利娟，任 雪，范慧红.骨肽及复方骨肽注射液降压物质的研究［J］.中国生化药物杂志，2010，31（4）231.

［2］Murray J，Favus MD.Primer on the metabolic bone disease and disorders of mineral metabolism ［M］.4th ed.Philadelphia（USA）：Lippincott Williams ＆ Wilkins，1999.16－18.

［3］Caetano－Lopes J，Canhao H，Fonseca JE.Osteoblast and bone formation［J］.Acta Reumatol Port，2007，32（2）：103.

［4］Frederic Shapiro.Bone development and its relation to fracture repair：The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts［J］.European Cells and Materials，2008，15：53.

［5］P.Chavassieux，E.Seeman，and P.D.Delmas.Insights into material and structural basis of bone fragility from diseases associated with fractures：How determinants of the biomechanical properties of bone are compromised by disease［J］.Endocrine Reviews，2008，28（2）：151.