PTTG基因沉默对人胰腺癌细胞PANC－1细胞增殖的影响

王 宁，姜海容，刘 洁，阎 英

（1.沈阳军区总医院 放疗科，沈阳110015；2.长春市中心医院 肿瘤科，长春130051；3.中国医科大学实验技术中心，沈阳110001）

垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforminggene，PTTG）与多种肿瘤的发生发展关系密切［1］。近来有研究证实人胰腺癌中PTTG也存在高表达［2］，但PTTG对胰腺癌细胞增殖及调控机制的研究未见报道。本研究利用小干扰RNA下调PTTG基因表达，观察其对细胞增殖的影响。

1 实验材料

1.1 材料

人胰腺癌PANC－1由中科院上海细胞生物研究所提供。siRNA－PTTG和阴性对照siRNA由Qiagen公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及基因沉默效应检查 将PANC－1细胞分为3组（①.未转染PANC－1细胞、②.转染阴性对照siRNA、③转染siRNA－PTTG）。基因沉默效应检查详见另文［3］。

1.2.2 形态观察及细胞增殖测定 倒置显微镜观察不同转染组细胞形态学变化。胰酶消化对数生长期细胞制备单细胞悬液，浓度为1×105个／ml，96孔板每孔接种100μl细胞悬液，5%CO2，37℃孵育24 h后，吸去培养上清，用无血清opti－MEM轻洗两次后进行基因沉默，6h后换上新鲜细胞培养液100 μl／孔，分别收集转染后24h、48h、72h和96h的细胞，距离时间点结束4h时小心吸去上清，加入80μl无血清培养液，再加入2 0μl MTT溶液（5mg／ml）继续培养4h，然后吸掉上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，摇床低速振荡10min，充分溶解结晶物，混匀后于酶标仪于570nm处读取各孔吸光度（A570值），每组设定5个复孔。

1.2.33H－TdR测定DNA合成 胰酶消化对数生长期细胞制备单细胞悬液，浓度为1×105个／ml，96孔板每孔接种100μl细胞悬液，5%CO2，37℃孵育24h后，吸去培养上清，用无血清opti－MEM轻洗两次后进行基因沉默，48h后加入1.0μCi／孔3HTdR，继续培养6h，然后收获细胞于玻璃纤维滤膜上，抽洗至少2次，60℃－80℃烤干后，将滤膜放入装有4ml闪烁液的闪烁瓶中，暗处放置15min，MicroBeta Trilux 1450液闪和化学发光检测仪测定各管每分钟脉冲计数（Count percent minute，cpm）计算抑制率。抑制率（%）＝（对照组CPM值－实验组CPM值）／对照组CPM值×100

1.2.4 细胞周期分析 转染后48h，收集细胞，用70%乙醇4℃固定24h，加入RNA酶（终浓度50 μg／ml），37℃反应1h，加入碘化丙啶 （PI，100μg／ml）溶液染色20－30min后，在BD流式细胞仪上进行检测分析。

1.3 统计学处理

实验数据用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用q检验，取P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA－PTTG 对 PANC－1细胞增殖能力的影响

倒置显微镜下可见未转染和转染阴性对照siRNA的PANC－1细胞生长旺盛，形态未见差别，皆为致密贴壁生长多角形，细胞轮廓清晰，伸展良好，折光性强胞浆内未见颗粒和空泡。经siRNA－PTTG处理的PANC－1细胞形态不规则，体积减小，贴壁细胞数量减少，脱落和悬浮细胞增多，细胞质回缩，折光率下降。

转染siRNA－PTTG后各时间点细胞吸光度低于未转染和转染阴性对照siRNA组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；未转染和阴性对照组细胞吸光度值无统计学差异（P＞0.05），结果见表1。

表1 MTT分析不同组PANC－1细胞的吸光度值

2.2 siRNA－PTTG 对3 H－TdR 掺入PANC－1细胞DNA合成的影响

siRNA－PTTG组3H－TdR掺入率的放射性计数明显低于未转染PANC－1细胞和转染阴性对照siRNA组，其DNA合成抑制率为37.87%，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2），表明PTTG基因下调能够抑制细胞DNA合成。

表2 siRNA－PTTG 对3 H－TdR掺入PANC－1细胞DNA合成的影响

2.3 siRNA－PTTG对PANC－1细胞周期的作用

与未转染PANC－1细胞和转染阴性对照siRNA组细胞相比，转染siRNA－PTTG后G0／Gl期细胞百分率升高为58.96±12.14，显著高于阴性对照组的39.42±9.45和未转染 PANC－1细胞组的36.75±10.28，差异具有统计学意义（P＜0.05）；转染siRNA－PTTG后S期比例下降为28.41±6.78，显著低于阴性对照组的43.39±12.05和未转染PANC－1细胞组的42.21±11.74，差异具有统计学意义（P＜0.05），具体结果详见表2。未转染PANC－1细胞和转染阴性对照siRNA相比，G0／G1期及S期比率无统计学差异（P＞0.05）。结果提示，siRNA－PTTG显著抑制PANC－1细胞增殖，细胞周期阻抑在G0／G1期，DNA合成显著降低。

3 讨论

胰腺癌是恶性度较高的胃肠道肿瘤，发病率逐年上升，常规治疗方法效果有限，探寻新的治疗方法具有重要意义。随着RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的发展，通过该方法沉默癌基因表达在胰腺癌治疗上显示出巨大的优势［4］。PTTG基因是近年来发现的在多种肿瘤组织中异常表达的一种癌基因［1］，其在胰腺癌中的表达高于癌旁组织、胰腺良性肿瘤和正常胰腺组织，并和胰腺癌侵袭，分化相关［5］，但尚没有研究证明其和胰腺癌增殖的关系。

表3 siRNA－PTTG对不同实验组细胞周期影响

PTTG与肿瘤细胞增殖关系密切，现有的研究表明其在不同的肿瘤，不同的生理病理条件下，可能发挥不同的作用，结果间存在很大差异。由于PTTG编码的securin具有抑制姐妹染色单体分离的功能，其过表达可能会通过延迟有丝分裂、抑制姐妹染色单体分离从而抑制细胞增殖［6］。还有研究报道其还可通过诱导细胞凋亡实现其抑制细胞增殖的作用［7］。一些动物模型和细胞转染实验均证实如此。研究发现小鼠成纤维细胞系3T3高表达PTTG蛋白可抑制细胞增殖并引起细胞转化，成瘤性降低［8］；将hPTTG转染至HeLa和A549细胞，发现细胞增殖受到明显抑制［9］。与此相反，另一些实验却发现PTTG作为一种细胞转化癌基因，具有激活增殖的功能。在垂体腺瘤和平滑肌瘤，PTTG表达与细胞增殖相关标志－增殖细胞核抗原（PCNA）或Ki－67表达高度相关［10，11］。在鼠垂体成瘤模型［12］和甲状腺滤泡癌［13］，PTTG缺失可导致垂体和甲状腺细胞增殖减低。垂体细胞、肝细胞、神经胶质瘤细胞系U87和培养的子宫肌瘤细胞中PTTG表达水平与增殖活力成正相关［14，15］。使用基因敲除技术使PTTG缺失的研究也证实在骨髓干细胞、胶质瘤、肉瘤、肝癌和促皮质激素细胞中PTTG具有刺激增殖的作用［16，17］。尽管 Kim 等［13］研究发现 PTTG 可以诱导甲状腺滤泡癌细胞系FTC133增殖，但Saez［18］和Boelaert等［19］的研究则认为PTTG与甲状腺癌细胞增殖之间无相关性。

本研究利用化学合成的siRNA沉默PANC－1细胞内PTTG表达，经RT－PCR和Western blot证实其沉默效应［3］。倒置显微镜下观察发现经siRNA－PTTG处理的PANC－1细胞形态不规则，体积减小，贴壁细胞数量减少，脱落和悬浮细胞增多，细胞质回缩，折光率下降。这些细胞形态学的变化提示经siRNA－PTTG处理后的PANC－1细胞生长受到抑制。MTT比色法结果显示，siRNA－PTTG组各时间点的吸光度值均下降，细胞增殖速度明显降低，而未转染和阴性对照siRNA组增殖速率相近，吸光度无统计学差异。3H－TdR掺入实验表明未转染PANC－1细胞和转染阴性对照组放射性计数明显高于siRNA－PTTG组，表明PTTG基因沉默能够抑制PANC－1细胞DNA合成。细胞周期分析发现，转染siRNA－PTTG后G0／Gl期细胞百分率显著增加，S期显著降低。由此可见，PTTG具有促进体外培养胰腺癌细胞增殖的作用，其表达下调可通过抑制DNA合成导致细胞增殖下降。因此，PTTG有望成为胰腺癌早期诊断和基因治疗的新靶点，但其调控细胞增殖的确切机制和路径仍有待于进一步研究。

［1］Boelaert K，Tannahill LA，Bulmer JN，et al.A potential role for PTTG／securin in the developing human fetal brain［J］.FASEB J，2003，17（12）：1631.

［2］Zhang ML，Lu S，Zheng SS.Epigenetic changes of pituitary tumorderived transforming gene 1in pancreatic cancer［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7（3）：313.

［3］王 宁，王冠军，刘 洁.小干扰RNA抑制PTTG基因对人胰腺癌细胞PANC－1侵袭能力的影响［J］.中国实验诊断学，2009，13（11）：1527.

［4］王唯一，毛振彪，黄介飞.RNA干扰技术在胰腺癌基因治疗中的应用［J］.国际消化病杂志，2007，27（4）：284.

［5］王雪飞，王立秋.人垂体瘤转化基因在胰腺恶性肿瘤中的表达及其意义［J］.中国医药导刊，2010；79（5）：839.

［6］Yu R，Cruz－Soto M，Li Calzi S，et al.Murine pituitary tumortransforming gene functions as a securin protein in insulin－secreting cells［J］.J Endocrinol，2006，191（1）：45.

［7］Tfelt－Hansen J，Kanuparthi D，Chattopadhyay N.The emerging role of pituitary tumor transforming gene in tumorigenesis［J］.Clin Med Res，2006，4（2）：130.

［8］Stratford AL，Boelaert K，Tannahill LA，et al.Pituitary tumor transforming gene binding factor：a novel transforming gene in thyroid tumorigenesis［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90（7）：4341.

［9］Mu YM，Oba K，Yanase T，et al.Human pituitary tumor transforming gene（hPTTG）inhibits human lung cancer A549cell growth through activation of p21（WAF1／CIP1）［J］.Endocr J，2003，50（6）：771.

［10］Filippella M，Galland F，Kujas M，et al.Pituitary tumour transforming gene（PTTG）expression correlates with the proliferative activity and recurrence status of pituitary adenomas：a clinical and immunohistochemical study［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2006，65（4）：536.

［11］Tsai SJ，Lin SJ，Cheng YM，et al.Expression and functional analysis of pituitary tumor transforming gene－1［corrected］in uterine leiomyomas［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005；90（6）：3715.

［12］Genkai N，Homma J，Sano M，et al.Increased expression of pituitary tumor－transforming gene（PTTG）－1is correlated with poor prognosis in glioma patients［J］.Oncol Rep.2006；15（6）：1569.

［13］Kim CS，Ying H，Willingham MC，et al.The pituitary tumortransforming gene promotes angiogenesis in a mouse model of follicular thyroid cancer［J］.Carcinogenesis，2007，28（5）：932.

［14］Yao YQ，Xu JS，Lee WM，et al.Identification of mRNAs that are up－regulated after fertilization in the murine zygote by suppression subtractive hybridization［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，304（1）：60.

［15］Vlotides G，Cruz－Soto M，Rubinek T，et al.Mechanisms for growth factor－induced pituitary tumor transforming gene－1expression in pituitary folliculostellate TtT／GF cells［J］.Mol Endocrinol，2006，20（12）：3321.

［16］Cho－Rok J，Yoo J，Jang YJ，et al.Adenovirus－mediated transfer of siRNA against PTTG1inhibits liver cancer cell growth in vitro and in vivo［J］.Hepatology，2006，43（5）：1042.

［17］Rubinek T，Chesnokova V，Wolf I，et al.Discordant proliferation and differentiation in pituitary tumor－transforming gene－null bone marrow stem cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，293（3）：C1082.

［18］Saez C，Pereda T，Borrero JJ，et al.Expression of hpttg proto－oncogene in lymphoid neoplasias［J］.Oncogene，2002，21（53）：8173.

［19］Boelaert K，McCabe CJ，Tannahill LA，et al.Pituitary tumor transforming gene and fibroblast growth factor－2expression：potential prognostic indicators in differentiated thyroid cancer［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88（5）：2341.