Klotho基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的实验研究

韩 冬，徐 煌，郑永霞，肖燕萍

（嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴314001）

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪间充质干细胞），是一类存在于脂肪基质中，具有自我更新能力和多分化潜能的成体干细胞。ADSCs取材方便，是细胞治疗的良好种子细胞来源［1］。klotho是一种抗衰老基因，其基因缺陷型动物出现多种过早衰老的症状，如寿命缩短、骨质疏松、皮肤肌肉萎缩、听力下降、软组织钙化等［2，3］。研究发现，klotho可以影响细胞的增殖，因此本研究将klotho基因转染至ADSCs中观察其对ADSCs增殖能力的影响，为深入研究klotho基因功能及ADSCs作为种子细胞进行细胞治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM细胞培养液购自美国GIBCO公司，碘化丙碇（PI）购自美国sigma公司，Cell Counting Kit－8（CCK－8）购自日本同仁化学研究所，兔抗人cyclinD1抗体，HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中杉公司。转染试剂lipofectamine2000购自美国invitrogen公司，其他化学试剂为国产分析纯，质粒 pcDNA3.1－GFP、pcDNA3.1－GFP－KL 由吉林圣元科技有限公司惠赠。

1.2 ADSC的分离 取脂肪吸脂术的脂肪抽提物50mg，用PBS溶液反复冲洗3次，然后依次加入5 ml的0.5%胰酶和0.1%胶原酶，置37℃细胞培养箱内消化15min，1 000rpm离心10min后去上清，PBS冲洗3次后，低速离心，弃掉漂浮的脂肪及脂滴，200目纱网过滤，收集细胞，将分离的单细胞移入培养皿中，10%FBS的DMEM、37℃、5%CO2条件下培养。

1.3 Klotho基因的细胞转染 将质粒pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL （含有klotho全长基因序列）通过转染试剂lipofectamine2000分别转染至ADSC中，具体操作按说明书进行。在转染后24 h、48h、96h采用 CCK－8法测定细胞增殖。将pcDNA3.1－GFP转染组、pcDNA3.1－GFP－KL转染组和未转染组的ADSC细胞悬液分别调整至浓度为2.5×105／ml接种于96孔板，每孔加200μl调整好浓度的细胞悬液，37℃、5%CO2饱和湿度培养，每孔加入CCK－8溶液10μl，继续培养2h，酶标仪上检测各孔450nm处的OD值，以650nm波长为参考波长进行双波长测定，以未转染组为对照组，以pcDNA3.1－GFP转染组、pcDNA3.1－GFP－KL转染组为实验组，按照公式：细胞增殖率＝实验组（A）／对照组（A）×100% 计算细胞增殖率，比较各组间增殖率的差异。

1.4 Western blot法检测细胞周期蛋白cyclin D1的表达 取第96h平行培养的未转染组和pcDNA3.1－GFP转染组、pcDNA3.1－GFP－KL转染组的细胞，胰酶消化，含血清的培养基终止胰酶的作用，收集细胞于离心管中，细胞计数后4 000rpm离心5min，预冷PBS洗3次，弃上清，加入细胞裂解液150μl冰上孵育10min，14 000rpm离心10 min，收集上清。采用BCA蛋白定量法测定各组总蛋白浓度，取等量总蛋白在分离胶浓度为12%的条件下进行SDS－PAGE电泳，电泳结束后常规转膜，依次用兔抗人cyclin D1的一抗和羊抗兔酶标二抗孵育，以β－actin为对照，检测pcDNA3.1－GFP转染组、pcDNA3.1－GFP－KL 转染组和未转染组cyclin D1的表达。

1.5 流式细胞仪测定ADSC的细胞周期 分别收集未转染组和pcDNA3.1－GFP转染组、pcDNA3.1－GFP－KL转染组的细胞1×106个于离心管中，1 000rpm离心5min，弃上清加入1ml 70%预冷的乙醇4℃过夜。1 000rpm离心5min，弃上清，用PBS离心洗涤2次，加入1ml DNA抽提缓冲液（192ml 0.2mol／L Na2HPO4与8ml 0.1mol／L枸橼酸的混合溶液），混匀室温放置5min，1 000 rpm离心5min弃上清，将细胞重悬于浓度为100 mg／L的PI溶液中，室温避光染色30min后流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 镜下观察分离和质粒转染的ADSC形态 光镜下观察可见分离培养的ADSC呈贴壁生长，细胞形态为梭形，原代培养的细胞24h内即贴壁生长，转染pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL质粒的ADSC在荧光显微镜下呈现绿色荧光，证明质粒已成功转染入ADSC中，见图1。

图1 分离及转染后ADSC的细胞形态

2.2 CCK－8法测定细胞增殖 测定吸光度值后计算各组增殖率，pcDNA3.1－GFP－KL组与未转染组相比ADSC的增殖率在第24h、48h、96h分别为124.75%、140.52%、175.50%。而 pcDNA3.1－GFP组与未转染组相比的增殖率在第24h、48h、96h分别为100.99%、101.29%、100.22%，细胞增殖率与对照组相比无明显差异，各组吸光度结果见表1，细胞形态见图2。

2.3 cyclinD1蛋白的表达western blot结果显示pcDNA3.1－GFP－KL转染组与 pcDNA3.1－GFP转染组和未转染组相比cyclin D1蛋白的表达水平明显增高，结果见图3。而转染pcDNA3.1－GFP组和未转染组相比cyclinD1蛋白的表达水平无明显差异，而3组细胞的β－actin蛋白的表达无明显差异。

表1 各组细胞不同时间的吸光度值

图2 未转染组及转染组96hADSC的细胞形态

图3 western blot检测各组细胞cyclinD1的表达

2.4 流式细胞仪检测细胞周期 未转染组、pcDNA3.1－GFP－KL转染组和pcDNA3.1－GFP转染组的细胞周期分析结果显示，pcDNA3.1－GFP－KL转染组G0／G1期的细胞明显减少（P＜0.05），而S期细胞明显增多（P＜0.05），G2／M 期细胞也增多（P＜0.05），而未转染组和pcDNA3.1－GFP转染组的细胞周期分析无明显差异，结果见表2。

表2 流式细胞仪测定各组细胞的细胞周期

3 讨论

人klotho基因位于17号染色体的大臂，全长5.2kb，由5个外显子和4个内含子组成［4］。Klotho是一种抗衰老基因，研究发现klotho基因发生突变可导致动物出现过早衰老症状及寿命缩短，而过表达klotho基因的小鼠则出现衰老抑制和寿命延长［5］。Klotho基因通过双向作用发挥抗衰老的作用，体现为一方面抑制肿瘤细胞增殖，另一方面促进正常细胞增殖。已有研究证实Klotho基因可抑制IGF－1信号通路进而抑制肿瘤细胞增殖，而klotho基因也可抑制过量的维生素D引起的细胞凋亡，激活细胞的有丝分裂来发挥其促进正常细胞增殖作用［6，7］。klotho随着年龄的增长和某些疾病条件下其表达呈下降趋势。在自发性高血压大鼠和糖尿病大鼠中持续的高压和氧化应激使klotho表达明显下降，在人慢性肾脏疾病中klotho表达也呈下降趋势［8－10］，因此采用klotho基因转染的手段，可以提高klotho在细胞的表达量，进而达到促进细胞增殖及抗衰老的目标。

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪间充质干细胞），是一类存在于脂肪基质中，具有自我更新能力和多分化潜能的成体干细胞，研究证实它可分化为脂肪细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经细胞等多种成体细胞。ADSCs可从吸脂术中的废弃脂肪中分离，取材极为方便，ADSC认为是替代骨髓间充质干细胞用于细胞移植的理想种子细胞。ADSC在体外培养时，血清浓度、细胞密度等培养条件对其增殖能力影响较大。在既往研究中，我们发现ADSC增殖周期为1w左右，如能提高ADSC的体外增殖能力，在体外大量扩增ADSC，将为ADSC作为种子细胞进行细胞移植、构建工程化组织提供实验基础。

本研究中使用细胞转染手段，将Klotho基因转染至培养的ADSC中，通过CCK－8检测细胞增殖能力，实验结果为在转染后96hpcDNA3.1－GFP－KL转染组的增殖能力为未转染组的175.50%，而通过流式细胞仪检测细胞周期发现，转染klotho基因后ADSC在静止期（G0／G1期）细胞数明显减少，而合成期 （S期）和有丝分裂期 （G2／M期）的细胞数明显增多，说明ADSC转染klotho基因后细胞的增殖能力明显增强，而通过免疫组化的测定结果发现，ADSC中cyclinD1蛋白的表达在转染klotho基因后明显增高，而cyclinD1蛋白也是使细胞进入合成期，促进细胞增殖的必要条件，以上实验结果均说明转染klotho基因可增强体外培养ADSC的增殖能力。

Klotho作为抗衰老基因，其研究尚处于起步阶段，其发挥抗衰老促进正常细胞增殖的分子机制有待深入研究。本研究采用转染klotho基因的方法提高了ADSC体外增殖能力，为进一步研究klotho基因抗衰老的机制和将ADSCs用于细胞移植治疗疾病打下实验基础。

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