应用基于[1H]NMR的代谢组学评价逍遥散的抗抑郁有效组分

芦林林，周玉枝，马致洁，武 滨，秦雪梅

(山西大学1.中医药现代研究中心，2.化学化工学院，山西太原 030006;3.山西医药集团公司，山西太原 030012)

抑郁症是以显著而持久的情绪低落、活动能力减退、思维与认知功能迟缓为主要临床特征的情感性精神障碍[1]。世界卫生组织预测到2020年抑郁障碍将成为发展中国家最严重的疾病。逍遥散方，出自于宋代《太平惠民和剂局方》，由柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、生姜、薄荷和甘草共8味药组成，具有疏肝解郁之功效。现代临床应用及实验研究均显示该方有确切的预防和治疗抑郁症的作用[2]，但是此复方产生抗抑郁作用的有效组分并不确定。

代谢组学是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法，可通过揭示新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律，全面理解病理变化过程及机体内物质的代谢途径[3]。它一般借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，分析细胞、组织和其它生物样本中内源性代谢物整体组成并通过其复杂的、动态的变化来辩识和解析被研究对象的生理病理状态[4]。目前，基于[1H]核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)的代谢组学技术已经成为一种强有力的工具，被广泛的应用于基础生物学、分子病理学、临床诊断、生物医药和环境科学等各种不同的领域[5]。

目前，逍遥散复方抗抑郁作用研究较多[2，6－7]，但是对于逍遥散抗抑郁有效组分的研究还未见报道。本课题组前期通过小鼠悬尾及强迫游泳实验及大鼠慢性温和不可预知应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型行为学得出石油醚组分是逍遥散抗抑郁作用有效组分[8]。本研究建立大鼠CUMS模型，采用基于NMR的代谢组学系统生物学方法对大鼠血液代谢物的变化进行测定分析，通过评价5个不同极性组分的抗抑郁作用以确定逍遥散抗抑郁作用的有效组分，为进一步阐明逍遥散抗抑郁作用的药效物质基础提供重要的基础信息。

1 材料与方法

1.1 药材及提取鉴定

逍遥散复方药材(柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、生姜、薄荷、甘草)均购自山西省华阳药业。

称取按比例混合的逍遥散复方药材(柴胡∶当归∶白芍∶白术∶茯苓∶生姜∶薄荷∶甘草=6∶6∶6∶6∶6∶2∶2∶3)大约3 kg，加无水乙醇20 L加热回流提取2次(每次2 h)，合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏，得醇提物;醇提物溶解于1 L水中，加等体积石油醚萃取，得石油醚组分(XY-A)15.65 g;水组分过D101大孔吸附树脂柱，依次用30%，60%和95%乙醇洗脱，得30%，60%和95%乙醇组分XY-B(60 g)，XY-C(11.74 g)和XY-D(15 g)。将复方乙醇提取后的药渣加水24 L回流提取2次(每次2 h)，合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏，置真空干燥箱中烘干，得组分XY-E(160 g)。各组分的提取、分离流程图如图1所示。

Fig.1 Flow diagram of fractionation of the Xiaoyaosan prescription.

1.2 试剂与仪器

D2O购自美国默克试剂公司，Varian NMR System 600MHz超导NMR谱仪为美国瓦立安公司产品。

1.3 动物

SD成年雄性健康大鼠，体质量180～200 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK-(军)2007-004。动物先适应性饲养1周，保证自由摄食饮水，光照12 h/黑暗12 h，室温22～24℃，相对湿度35%～55%。

1.4 动物分组与给药

药物均溶于0.5%吐温80(W/V)1%CMC-Na溶液中。适应1周后，将大鼠随机分为正常对照组;模型组;XY-A 0.24 g·kg－1组;XY-B 0.92 g·kg－1组;XY-C 0.18 g·kg－1组;XY-D 0.23 g·kg－1和 XYE 2.44 g·kg－1，每组 6 只。

除正常对照组外，其余各组均单笼饲养并实施造模程序，造模时间为21 d。造模开始后同时ig给药，模型组及正常对照组给予等体积溶剂，每天1次，连续3周。

XY-A -XY-E组分的剂量根据本课题组前期研究[7]得到的逍遥散有效剂量和提取物出膏率计算得到有效剂量〔46 g(生药材)·kg－1，出膏率:XYA 为0.52%，XY-B 为2.0%，XY-C 为 0.39%，XY-D为0.5%，XY-E 为5.32%〕。

1.5 慢性温和不可预知应激模型的建立

除正常对照组外，其余组均在每天ig给予药物30 min后随机给予应激刺激，每日1种，持续21 d。参照文献[9]方法并加以改进，刺激因素包括夹尾1 min、禁水(24 h)、电击足底、陌生物品(如塑料杯、木勺、碎布片等)、禁食24 h、4℃冰水游泳 5 min、潮湿垫料和倾斜45°、束缚应激4 h、45℃热应激5 min和噪音刺激(60 Hz，1 h)等。

1.6 血浆样品采集

实验第22天大鼠股动脉取血，置于肝素钠抗凝管中，摇匀。4℃ 3400×g离心5 min取上清液，4℃再次13600×g离心5 min，取上清液，保存于－80℃冰箱，待分析。

1.7 [1H]核磁共振代谢组学分析

1.7.1 血浆样品预处理

冰水混合溶液解冻血浆样品，取血浆250 μl于抗凝管中，加入350 μl D2O(锁场作用)，4℃时14500×g离心20 min，取上清液500 μl于内径5 mm的核磁管中。

1.7.2 [1H]核磁共振波谱

不同的核磁序列可对血浆中不同代谢物进行测定:NOESY序列压制水峰的同时可检测血浆中全部代谢物;Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列可以压制水峰和大分子物质的信号，从而检测血浆中的小分子代谢物;扩散编辑序列(LED-BPP序列)则可以去掉小分子代谢物，测定血浆大分子代谢物。本实验采用CPMG序列对血浆中小分子代谢物进行分析测定，具体参数设置如下:CPMG脉冲序列:自旋弛豫延迟为320 ms，自由感应衰减为64 K数据点，谱宽为8000 Hz，扫描次数:64次。

1.8 多元统计分析

1.8.1 [1H]NMR 数据处理

采用MestReNova核磁图谱专业处理软件对所有NMR图谱进行傅立叶转换并进行相位、基线调整。在CPMG图谱中，以肌酸的化学位移(δ)3.04为标准对谱图进行化学位移的校正。以0.01 ppm为单位，对δ 0.5～4.5区域的谱图进行等宽度分割;然后对所得图谱进行分段积分，即得到与化学位移值段相对应的积分值。采用归一化法，将数据归一化处理，使数据集中在0～1范围内，用于多变量统计分析。

1.8.2 统计学分析

应用SIMCA-P11.0软件将积分数据进行中心化和规格化后，进行模式识别分析。模式识别包括非监督模式识别和有监督模式识别。有监督模式识别分析即在样品分类的基础上进行模式识别，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的模型对未知的样本进行预测。应用于该领域的主要有偏最小二乘法-显著性分析(PLS-discriminant analysis，PLSDA)，正交偏最小二乘法-显著性分析(orthogonal partial least squares-lineardiscrimination analysis，OPLS-DA)等[10]。本实验采用的是PLS-DA模式识别分析，在PLS-DA分析前，采用信号校正的方法(orthogonal signal correction，OSC)以移除不相关因素变化的影响。

2 结果

2.1 [1H]NMR图谱的指认

图2中所示，正常对照组、模型组及XY-A～XY-E组大鼠血浆中小分子代谢物的CPMG谱。经参考文献[11－14]方法，共指认了其中的14种代谢物。其中，1.2 ppm处的三重峰与4.1 ppm处的多重峰来自于麻醉剂乌拉坦，在进行数据统计分析时排除后再进行归一化处理。

Fig.2 Typical Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)spectra in plasmas of rats.A:control;B:model;C:XY-A;D:XY-B;E:XY-C;F:XY-D;G:XY-E.Peak 1:Leucine/Isoleucine;peak 2:Valine;peak 3:β-HB;peak 4:Lactate;peak 5:alanine;peak 6:N-acetyl glycoprotein;peak 7:acetoacetic acid;peak 8:pyruvate;peak 9:glutamic acid;peak 10:creatine;peak 11:choline;peak 12:Trimethylamine N-oxide(TMAO);peak 13:glucose;peak 14:β-glucose;peak 15:αglucose.

2.2 代谢组学OSC-PLS模式分析逍遥散不同组分对代谢谱图的影响

为了从[1H]NMR复杂的数据中观察到微小的、重要的变化，进一步确定逍遥散不同组分的抗抑郁作用，采用了OSC-PLS模式识别方法对小分子代谢物所得的数据进行了分析。

由图3A～E可见，正常对照组和模型组能够分开，说明造模可以对动物的代谢谱产生影响。图3A表明XY-A组分组沿第一主成分与模型组明显分开，与正常对照组非常接近。而图3B～E虽然显示模型组与正常对照组能够分开，但其余各组分组均与模型组非常接近，离正常对照组较远，说明这4个组分组小分子代谢轮廓与模型组没有差异。说明XY-A组分组使血浆中生物标志物发生了一定的改变，与模型组代谢物代谢轮廓有较大的不同。

Fig.3 Effect of different fractions on small metabolites in plasmas of rats by OSC-PLS score plots analysis.A:XY-A group;B:XY-B group;C:XY-C group;D:XY-D group;E:XY-E group.n=6.

2.3 代谢组学PLS-DA模式分析CUMS模型对大鼠产生的可能差异代谢物

如图4A所示，正常对照组与模型组能够明显分开，说明造模可以对动物的代谢谱产生影响，而导致这种空间位置不同的原因则反映在相对应的Loading图(图4B)中。离原点较远的那些点对模型组和正常对照组的分离具有较大的贡献。根据VIP统计学的准则，当这些变量的VIP＞1时，并结合独立样本t检验方法，P＜0.05可以被认为是潜在的生物标志物。采用上述方法，结果显示，与正常对照组大鼠相比，CUMS模型能引起大鼠血浆中乳酸(δ1.33～1.35，δ4.11～4.14)、丙酮酸(δ2.38)、氧化三甲胺 (δ3.27)、肌酸 (δ3.05)、3-羟基丁酸(δ1.13)、缬氨酸 (δ0.99)和亮氨酸/异亮氨酸(δ0.93)等含量的降低，而糖类(δ3.40 － 4.00)、胆碱(δ3.23)、丙氨酸(δ1.47)等含量上升。

Fig.4 Score plot(A)and loading plot(B)in normal control and model groups by PLS-DA analysis.A:● nomal;■model.

2.4 XY-A组分对部分差异性代谢物的调节作用

如图5A所示，XY-A组与模型组能够明显分开，说明XY-A组与模型组代谢轮廓是不同的。从对应的Loading图(图5B)中，可以得到，服用XY-A组分后可使大鼠血浆中丙酮酸(δ2.38)、氧化三甲胺(δ3.27)、肌酸(δ3.04)、3-羟基丁酸(δ1.13)和亮氨酸/异亮氨酸(δ0.93)等含量的升高，而糖类(δ3.40～4.00)、胆碱(δ3.23)和丙氨酸(δ1.47)等含量降低。

模型组及XY-A组分组的潜在生物标志物及变化情况如表1所示。

Fig.5 Score plot(A)and loading plot(B)in XY-A and MS groups by PLS-DA analysis.A:▲ XY-A group;■ model group.n=6.

Tab.1 Possible potential biomarkers in model and XY-A groups

3 讨论

CUMS模型是综合了慢性应激和孤养两种经典模型相结合的建模方法，制作慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型，其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症的发生并加速抑郁症发展的机理更接近。

采用NMR的代谢组学方法，发现给药21 d后，与其他组大鼠相比，XY-A组与正常对照组最为接近，说明XY-A组可以使血浆中的生物标志物发生一定的改变，与模型组代谢轮廓不同，结合前期行为学结果[8]，表明与其他组分组相比，XY-A组有明显的抗抑郁作用。有报道，越鞠丸的石油醚组分[15]以及半夏厚朴汤的亲脂性组分[16]都有明显的抗抑郁作用，这与研究结果是一致的。说明在这些抗抑郁复方中，低极性成分发挥着重要的作用。

本文研究还表明:CUMS大鼠部分代谢物的改变引起了机体内部分代谢途径的改变。如氧化三甲胺在CUMS大鼠血浆中是降低的，但是有报道[17]显示当给予基因自由大鼠一个正常的环境后，大鼠体内会建立一个相对稳定的肠道菌群落，大鼠尿液中TMAO的含量会增加，说明本实验中各种刺激的干扰，影响了大鼠肠道的菌群。

亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸在CUMS模型组大鼠血浆中均显示降低的趋势。有研究[18]表明支链氨基酸与神经递质5-羟色胺(5-HT)的含量有着密切的关系。5-HT的含量和中枢疲劳有关[19]，而血浆中支链氨基酸含量的降低可能表明大脑5-HT的释放发生了紊乱。

能量不足或者疲劳是抑郁症患者的典型特征之一。肌酸-磷酸肌酸系统是细胞能量转换的关键，肌酸含量的降低及三羧酸循环中间产物3-羟基丁酸的下降，表明CUMS影响了机体的能量代谢[20]。

胆碱在神经传递中发挥着重要的作用。抑郁大鼠血浆中胆碱浓度的增加表明CUMS引起了大鼠血浆中与脂蛋白、磷脂等相关的代谢功能发生了障碍，这与文献的报道是一致的[21]。

本研究表明XY-A组分对于这些代谢物的改变起到了一定的作用，进一步确定了XY-A组分是逍遥散中有效的抗抑郁组分。但是，因为逍遥散中的成分是非常复杂的，所以还需要进一步研究。

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