羟基红花黄色素A对氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

盛 林，毕少杰，焦 波，马伟红

(1.山东大学第二医院心内科，山东济南 250033;2.山东大学药学院药理室，山东济南 250012)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖是动脉粥样硬化、高血压和介入治疗后血管再狭窄的共同病理基础[1]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins，ox-LDL)可以损伤血管内皮细胞，刺激VSMC增殖或者诱导凋亡，导致动脉粥样硬化斑块稳定性下降[2－3]。近年研究还发现ox-LDL与冠状动脉介入治疗后血管再狭窄关系密切[4]。红花黄色素(safflor yellow)是从传统活血化瘀中药红花中提取而来，为多种水溶性查耳酮成分的混合物，被认为是红花中的主要有效成分。红花黄色素可进一步分离为红花黄色素A、红花黄色素B、红花黄色素 C，其中羟基红花黄色素 A(hydroxyl-safflor yellow A，HSYA)被认为是红花黄色素中含量最高的黄酮成分，也是红花发挥药理作用的主要物质。由于HSYA具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗栓和抗氧化等作用，可以有效缓解心绞痛发作，因而广泛应用于临床。有文献报道红花黄色素可以抑制VSMC增殖[5]，但是红花黄色素能否抑制ox-LDL诱导VSMC增殖，目前尚未见报道。本实验通过ox-LDL诱导VSMC增殖，探讨HSYA抑制VSMC增殖的信号调节机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

HSYA，纯度98%，分子式:C27H32O16，由山东省天然药物工程技术研究中心现代中药研究室提供;DMEM培养基和胰蛋白酶:Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青公司;磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2)单克隆抗体、丝裂原活化的蛋白激酶磷酯酶-1(mitogen-activated provein kinase phosphatase-1，MKP-1)单克隆抗体均为美国Cell Signal Technology公司产品;β肌动蛋白HRP标记羊抗兔IgG为晶美生物工程有限公司;β微管蛋白HRP标记羊抗兔IgG为美国Santa Cruz公司产品;PD98059为Sigma-Aldrich公司产品;发光底物(SuperSignal Western Pico Chemiluminescence Substrate)，美国 Pierce公司产品;牛血清白蛋白、碘化丙啶(propidium iodide，PI)为美国Amresco公司产品;N，N，N，N-四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED)、过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)、RNase均为美国Sigma公司产品;考马斯亮蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均为美国Bio Basic Inc.BBI公司产品;CO2细胞培养箱(美国Forma Scientific，Inc.公司);荧光显微镜(日本Olympus公司);酶联免疫检测仪(Multiskan Mk3，上海雷伯分析仪器有限公司);流式细胞仪(BD FACS Calibur);PCR仪系MT Research INC产品;DYY-Ⅲ6型稳压稳流电泳仪，上海医疗仪器厂产品;电泳及转膜装置(美国Bio-Rad公司);ox-LDL为北京欣源佳和生物科技公司;无水乙醇为天津市天新化学试剂开发中心产品。

1.2 细胞培养

SD大鼠由山东大学第二医院实验动物中心提供，许可证号:SYXK(鲁)20050050。取150 g左右雄性大鼠胸主动脉，剥去血管外膜，刮除内膜，剪成1 mm×1 mm组织块，贴于培养瓶内，于37℃，5%CO2条件下用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，3～5 d换液1次。待60%～80%融合时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代，4～6 d传代。细胞为梭形，长成致密细胞层时出现典型的“峰-谷”状结构。实验用第3～8代VSMC。

1.3 细胞分组处理

取1.2项培养的细胞，根据预实验结果，采用ox-LDL最佳刺激细胞增殖浓度35 mg·L－1和HSYA最佳抑制细胞增殖浓度 10 μmol·L－1进行实验，按照下述进行分组处理:正常对照组细胞用含0.5%胎牛血清DMEM 培养液培养，ox-LDL 35 mg·L－1组，HSYA 10 μmol·L－1+ox-LDL 35 mg·L－1组，PD9805910 μmol·L－1+ox-LDL 35 mg·L－1和PD9805910 μmol·L－1+HSYA 10 μmol·L－1+ox-LDL 35 mg·L－1组。细胞与药物共同培养48 h。

1.4 MTT 法检测细胞存活率[6]

取指数生长期细胞，经PBS洗涤后，用0.25%胰蛋白酶消化分散成单个细胞。取细胞接种于96孔培养板中，细胞数为每孔1×103个。置37℃，5%CO2孵箱中培养24 h，细胞贴壁后加入ox-LDL，每组6个复孔。继续培养24 h取培养板，经洗涤加入20 μl MTT 5 g·L－1，培养 4 h，去除培养液，加入DMSO后即在570 nm处测吸光度值(absorbance，A)，细胞存活率(%)=A处理组/A正常对照组×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞增殖周期

按1.2分组处理后用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，收集于离心管中，4℃，2000×g离心6 min，吸去上清，加入PBS洗涤2次，离心后弃上清，每管加入0.5 ml预冷的70%乙醇固定，4℃冰箱过夜。取出固定细胞，4℃，2000×g离心6 min，除去乙醇，加入预冷PBS洗涤2次，离心。每管样品中加入 537 μl PBS 和3 μl RNase，37℃孵育30 min。每管中加入60 μl PI染液，避光反应30 min，转移至流式管中于流式细胞仪检测。

1.6 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MKP-1 mRNA和ERK1 mRNA转录表达

将VSMC在24孔板中传代培养，按上述方法培养至终点。吸出培养液加入Trizol试剂，严格按照Gibco Trizol试剂盒说明书进行操作，提取VSMC总RNA。提取 10 μl RNA，冰上依次加入 0.2 μl Oligo dT 500 mg·L－1，2.5 μl dNTP(10 mmol·L－1)，0.5 μl M-MLV 逆转录酶2 MU·L－1，4 μl RT(5 × )，0.5 μl RNasin 4 kU·L－1，加三蒸水将总体积补至 20 μl 。然后37℃水浴 30 min，95℃ 10 min，0℃放置 5 min。置于－20℃冰箱备用。取逆转录产物5 μl作为扩增模板，分别加入 0.5 μl 上游引物 50 mmol·L－1，0.5 μl下 游 引 物 50 mmol· L－1，1 μldNTP 10 mmol·L－1，0.5 μl Taq 酶 5 kU·L－1，5 μl PCR 缓冲液(10 ×)，5 μl MgCl225 mmol·L－1，加三蒸水将总体积补至50 μl。放入PCR扩增仪，95℃预变性，并按以下条件扩增30个循环:91.6℃45 s，57℃60 s，72℃60 s，最后72℃延伸5 min。MKP-1序列为上游5'-TCTGGATTGTCGCTCCTTCT-3'，下游 5'-GTCTGCCTTGTGGTTGTCC T-3'，扩增产物长度为 619 bp;ERK1引物序列为上游5'-ACACATGCTTTGGGTCCTTC-3'，下游 5'-AGGAACAGCTCACAGCCCTA-3'，扩增产物长度为883 bp;GAPDH引物序列为上游5'-CATCACCATCTTCCAGGAGCA-3'，下游 5'-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3'，扩增产物长度443 bp。取PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电压电泳，采用复日FR-980A生物电泳图像分析仪进行琼脂糖凝胶扫描和扩增条带积分吸光度(integrated absorbance，IA)分析。以与内参GAPDH的IA比值表示MKP-1和ERK1mRNA的相对表达强度。

1.7 Western印迹法测定ERK1/2和MKP-1蛋白表达

取对数生长期细胞，以1×108L－1的密度接种于6孔板中，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养至90%融合，收集1.3处理的细胞，冰PBS洗涤3次，在冰浴条件下加入适量裂解液裂解细胞，14000×g离心15 min，小心吸取上清，BCA试剂测定蛋白含量，取40 μg蛋白样品上样 ，以10%SDS-PAGE凝胶电泳分离(积层胶80 mV，分离胶120 mV)后电泳转移(150 mA，1.5 h)至PVDF膜上，丽春红染色观察蛋白质转移情况。5%的脱脂奶粉封闭1 h后，分别以兔抗 MKP-1(1∶1000)，ERK1/2(1∶1000)单克隆抗体 4℃孵育过夜，TBST洗脱后，二抗(1∶5000)室温下孵育1h后，电化学发光免疫分析(ECL)显色。用GIS图像处理系统分析目的条带的蛋白浓度，计算各蛋白条带和内参照的比值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 HSYA对ox-LDL诱导大鼠主动脉VSMC增殖的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，ox-LDL 35 mg·L－1组 VSMC 存活率明显增高，增加了 1.7倍，加入 HSYA 10 μmol·L－1后，细胞增殖受到明显抑制，细胞存活率降低了 60.4%(P＜0.01);加入ERK1/2特异性抑制剂 PD9805910 μmol·L－1，细胞存活率降低了58.3%(P＜0.01)。HSYA 10 μmol·L－1和 PD9805910 μmol·L－1同时加入细胞存活受到进一步抑制，细胞存活率下降了61.9%(P＜0.01)。HSYA 10 μmol·L－1，PD9805910 μmol·L－1单用或两药合用对细胞存活的作用无显著性差异。

Tab.1 Effect of hydroxyl-safflor yellow A(HSYA)on vascular smooth muscle cell survival stimulated by oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)by MTT assay

2.2 HSYA对ox-LDL诱大鼠主动脉VSMC周期的影响

表2和图1流式细胞术分析结果显示，与正常对照组相比，ox-LDL 35 mg·L－1组G0/G1期细胞下降了30.2%，S期细胞数增加了1.9 倍(P＜0.01)。加入 HSYA 10 μmol·L－1可显著抑制ox-LDL诱导细胞增殖周期，停滞于 G0/G1期的 VSMC(79.8±9.5)%(P＜0.05)。加入 PD9805910 μmol·L－1使(75.0±8.3)%的细胞停滞于G0/G1期(P＜0.01)。PD98059和HSYA同时加入VSMC增殖周期进一步受到抑制，G0/G1期细胞增加至(83.0±11.40)%，S期细胞减少至(17.0±2.6)%(P＜0.01)。HSYA，PD98059单用或两者合用对细胞周期的作用无显著差异。

Tab.2 Effect of HSYA on cell cycle in VSMC stimulated by ox-LDL

2.3 HSYA对ERK1和MKP-1基因表达的影响

Fig.1 Effect of HSYA on cell cycle in VSMC stimulated by ox-LDL.See Tab.1 for the treatment.A:normal control;B:ox-LDL 35 mg·L －1;C:ox-LDL 35 mg·L －1+HSYA 10 μmol·L －1;D:ox-LDL 35 mg·L －1+PD9805910 μmol·L －1;E:ox-LDL 35 mg·L －1+PD9805910 μmol·L －1+HSYA 10 μmol·L －1 .

Fig.2 Effect of HSYA on ERK1mRNA and MKP-1mRNA expression in VSMC stimulated by ox-LDL.See Tab.1 for the treatment.B was the semiquantitative result of A.1.control;2.HSYA;3.ox-LDL;4.ox-LDL+HSYA;5.ox-LDL+PD98059;6.ox-LDL+PD98059+HSYA.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with ox-LDL;△P＜0.05，compared with PD98059+ox-LDL.

图2 结果显示，HSYA 10 μmol·L－1对正常细胞ERK1和MKP-1基因表达无影响。与正常对照组相比，ox-LDL 35 mg·L－1组 VSMC ERK1 mRNA 表达量明显增高了2.2倍(P＜0.01)，MKP-1 mRNA表达虽然也略有增加，但无显著差异。与ox-LDL组相比，加入 HSYA 10 μmol·L－1，ERK1 mRNA 表达量下降了42.2%(P＜0.01)，MKP-1 mRNA表达显著增高，增加了 86.9%(P＜0.01);加入 PD9805910 μmol·L－1ERK1 mRNA 下降了45.9%(P＜0.01)，MKP-1 mRNA表达无明显差异;PD98059与HSYA同时加入，ERK1 mRNA表达进一步明显下降(P＜0.01)，且与单用药组有显著差异(P＜0.05)，MKP-1 mRNA显著增加，增加了110%(P＜0.01)，且显著强于PD98059单独作用组(P＜0.01)。

2.4 HSYA对 p-ERK1/2和 MKP-1蛋白表达的影响

图3结果显示，与正常对照相比，ox-LDL模型组p-ERK1/2显著增加，增加了33.3%(P＜0.01)，MKP-1蛋白略有减少，但无显著差异。与ox-LDL模型组相比，HSYA 10 μmol·L－1组 p-ERK1/2 表达减少了39.9%(P＜0.01)，MKP-1蛋白表达增加了80.6%(P＜0.01);PD9805910 μmol·L－1组p-ERK1/2表达下降了45.9%(P＜0.01)，MKP-1 蛋白表达增加了21.1%，但无显著差异;HSYA与PD98059同时加入，p-ERK1/2表达下降了51.2%(P＜0.01)，MKP-1 表 达 增 加 了 62.4%(P＜0.01)。

Fig.3 Effect of HSYA on the p-ERK1/2 and MKP-1 protein expression ofVSMC stimulated by ox-LDL 35 mg·L －1.See Tab.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.1.normal control;2.ox-LDL;3.ox-LDL+HSYA;4.ox-LDL+PD98059+HSYA;5.ox-LDL+PD98059.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with ox-LDL group;△P＜0.05，compared with ox-LDL+PD98059 group.

3 讨论

本研究结果表明，ox-LDL 35 mg·L－1可以显著增强ERK1/2基因转录和蛋白表达，推动细胞周期运行，刺激 VSMC 增殖。HSYA 10 μmol·L－1可以显著增强MKP-1基因转录和蛋白表达，抑制p-ERK1/2活性，通过诱导VSMC生长停滞在G0/G1期抑制ox-LDL刺激VSMC增殖。使用ERK1/2选择性抑制剂PD98059后，ox-LDL刺激ERK1/2表达和VSMC增殖的活性受到显著抑制，而 MKP-1表达不受PD98059影响，进一步证明ox-LDL刺激VSMC增殖是通过的ERK1/2信号转导通路，与MKP-1活性无明显关系。HSYA和PD98059与ox-LDL共培养的研究结果证明，HSYA可以显著增强细胞MKP-1基因转录和蛋白表达。

ERK1/2是细胞内调节细胞生长的最重要的信号蛋白激酶之一，包括生长因子、血管紧张素Ⅱ和内皮素等在内的许多刺激因子均通过活化ERK1/2促进 VSMC 增殖[7－8]。MKP-1 是 ERK1/2 的负性调控蛋白，通过脱磷酸化作用MKP-1可以灭活ERK1/2活性。因此，调控ERK1/2和(或)MKP-1表达将对VSMC增殖产生重要影响。ox-LDL对VSMC的生物学效应与其浓度有关，低浓度刺激细胞增殖而高浓度则诱导凋亡。研究表明，ox-LDL可以通过活化Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogenactivated protein kinase kinase kinase，MEK)/ERK1/2信号转导通路和诱导细胞周期蛋白D1表达刺激VSMC 增殖[9－13]。本研究显示，ox-LDL 显著增强ERK1 mRNA转录和磷酸化ERK1/2蛋白活性，推动VSMC由细胞周期G0/G1期向S/G2-M期转变，证实激活ERK1/2是ox-LDL刺激VSMC增殖的基本机制。MKP-1是 ERK1/2的负性调控蛋白，然而ox-LDL刺激细胞增殖与MKP-1表达变化是否有关，HSYA抑制ox-LDL刺激VSMC增殖是否也与MKP-1表达变化有关目前尚未见报道。本研究结果表明，ox-LDL在增强ERK1/2活性的同时并没有增加MKP-1转录和蛋白表达，因此，ox-LDL刺激VSMC增殖与 MKP-1并不相关，而可能是直接刺激ERK1/2转录，增强其磷酸化蛋白表达。

本实验结果还表明，ERK1/2选择性抑制剂PD98059是通过降低ERK1/2基因转录和p-ERK1/2表达抑制ox-LDL诱导VSMC增殖的，而对于MKP-1的基因转录与蛋白表达没有影响。与PD98059不同，HSYA在显著降低p-ERK1/2活性的同时明显增强了MKP-1基因转录和蛋白表达。因此，HSYA抑制细胞增殖的机制可能是由于通过增强MKP-1表达抑制了p-ERK1/2及其下游信号细胞周期蛋白D1活性，进而抑制细胞周期G0/G1期向S/G2-M期转变的结果。这可能是HSYA抑制ox-LDL诱导VSMC增殖的一个新的重要机制。

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