散结消瘿方对自身免疫性甲状腺炎大鼠自身抗体及病理结构的影响

李亮

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物选择 选用健康4～5周雌性Wistar大鼠60只，体质量约 (120±20)g。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂及仪器 主要试剂:猪甲状腺球蛋白 (Sigma公司，货号:T1126)100mg;完全弗氏佐剂 (Sigma公司，货号:F5881)10ml;不完全弗氏佐剂 (Sigma公司，货号:F5506)40ml，各两份。FT3试剂盒 (货号:L2KF32)、FT4试剂盒 (货号:L2KF42)、促甲状腺激素 (TSH)试剂盒 (货号:L2KTS2)、TGAb试剂盒 (货号:LKTG1)、TPOAb试剂盒 (货号:L2KTO2)，均由西门子有限公司提供。主要仪器:Vir 723可见光分光光度计 (上海精密仪器有限公司生产)、H－600型透射电镜 (日本日立公司)，LKB－V型超薄切片机，低温高速离心机、低温冰箱、德普自动生化分析仪®2000(天津德普诊断产品有限公司)、电子秤，精密天平，手术刀、剪、镊子、操作台等。

1.1.3 药物 散结消瘿方:蜣螂虫5g，莪术15g，三棱15g，土贝母15g，瓦楞子15g，郁金10g，猫爪草30g，柴胡10g，浓缩为浓度1g/ml液体药。雷公藤片 (三九黄石制药厂生产，批号:070805)制成0.1mg/ml溶液。碘化钠 (天津恒兴化学制剂有限公司)100g。

1.2 方法

1.2.1 分组 将健康的雌性Wistar大鼠60只，体质量约(120±20)g，购回后适应性饲养1周，随机分为4组:正常组 (G1)15只;模型组 (G2)15只;雷公藤治疗组 (G3)15只;散结消瘿方组 (G4)15只;

1.2.2 造模方法 G1组给予普通饲料饲养;G2～G4组造模:将甲状腺球蛋白100mg完全溶解于双蒸水50ml中，取10ml与等体积完全弗化剂充分混合成油包水状，取0.5ml在背、腹腔、腿、颈部等多点皮下注射为初次免疫，2周后取甲状腺球蛋白10ml与不完全弗化剂10ml充分混合后作加强免疫，每周1次，配合高碘水 (1L水中加入0.64g碘化钠配制)引水喂养至第5周［1］;第6周开始，G2组给予普通饲料及饮水饲养至10周;G3组给予雷公藤片1.08mg·kg－1·d－1〔给药方法按照动物每日用量 =成人每日用量 ×0.162×大鼠体质量(g)/150［2］〕灌胃至 10 周。

1.3 观察指标及检测方法 实验第11周处理大鼠，禁食8h后称重，用10%水合氯醛麻醉 (剂量40mg/kg［3］)，腹腔注射，15min后大鼠已处于麻醉状态，分两部分操作:一部分球后静脉取血，其中2ml给予肝素抗凝，余离心取血清备用;另一部分取出甲状腺组织约5mm3，以10%甲醛5ml固定，石蜡包埋切片后HE染色，光镜下检测，拍照纪录;各组实验大鼠取出甲状腺组织，制成HE染色切片，光镜下观察病理变化分级指数，评分标准［4－5］:0分:甲状腺内无炎性细胞浸润;1分:甲状腺间质浸润炎性细胞分布于2个或多个滤泡;2分:每个甲状腺滤泡的内有1～2个炎性细胞浸润;3分:炎性细胞浸润了10%～40%的甲状腺;4分:炎性细胞浸润了40%以上的甲状腺。分级标准:1级:0～1分，2级:1～2分，3级:2～3分，4级:3～4分。将取好的血液离心后取血清置于2～8℃保存备用。FT3、FT4、TSH、TGAb和TPOAb检测按剂盒说明进行操作、读数。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以 (±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清甲状腺球蛋白抗体及过氧化物酶抗体的变化 模型组TGAb和TPOAb较正常组升高，具有显著性差异(P＜0.01)。雷公藤治疗组TGAb和TPOAb较模型组降低，有显著性差异 (P＜0.05);散结消瘿方组TGAb和TPOAb较模型组降低，有显著性差异 (P＜0.01，见表1)。

2.2 各组大鼠甲状腺功能的变化 TSH含量正常组、模型组、雷公藤治疗组、散结消瘿方组间无显著性差异 (P＞0.05);FT3、FT4含量正常组、模型组、雷公藤治疗组、散结消瘿方组间无差异 (P＞0.05，见表2)。

2.3 各组大鼠病理指数 模型组淋巴细胞浸润程度较正常组明显增多，范围明显增大，具有显著性差异 (P＜0.05)。雷公藤治疗组淋巴细胞浸润程度较模型组显著降低，范围明显缩小，有显著性差异 (P＜0.05);散结消瘿方组淋巴细胞浸润程度较模型组显著降低，范围明显缩小，有显著性差异 (P＜0.01，见表3)。

表1 各组大鼠血清TGAb和TPOAb比较 (±s，U/mL)Table 1 Comparison of serum TGAb and TPOA in each group

表1 各组大鼠血清TGAb和TPOAb比较 (±s，U/mL)Table 1 Comparison of serum TGAb and TPOA in each group

注:与正常组比较，*P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05;与雷公藤组比较，#P＞0.05

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表2 各组大鼠甲状腺功能比较 (±s)Table 2 Comparison of thyroid function in each group

表2 各组大鼠甲状腺功能比较 (±s)Table 2 Comparison of thyroid function in each group

注:与模型组比较，*P＜0.05

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表3 各组大鼠病理指数分级变化 (±s)Table 3 Comparison of pathology index grade in each group

表3 各组大鼠病理指数分级变化 (±s)Table 3 Comparison of pathology index grade in each group

注:与正常组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.01

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3 讨论

自身免疫性甲状腺炎是在遗传基础上因性别、精神、感染、免疫等因素共同诱发的疾病。其外观上表现为弥漫性甲状腺肿大，中医病机属气、痰、血交阻于颈前下部而成。

3.1 实验结果分析 经过5周的治疗后，在炎性细胞浸润程度上，发现雷公藤治疗组、散结消瘿方组淋巴细胞浸润程度较模型组明显减低，范围明显缩小，滤泡上皮细胞嗜酸性变也明显变浅，说明雷公藤、散结消瘿方都可以减少淋巴细胞的炎性浸润，减低其免疫炎性反应。但散节消瘿方组淋巴细胞浸润程度较雷公藤治疗组明显减少，范围缩小，说明散结消瘿方较雷公藤治疗组更能有效减少淋巴细胞的炎性浸润，更好地控制自身免疫性炎的炎性反应。经治疗后雷公藤治疗组、散结消瘿方组大鼠TGAb和TPOAb较模型组有所降低，有显著性差异，说明雷公藤、散结消瘿方都可以减少自身免疫性甲状腺炎自身抗体的形成，减低其自身免疫反应;散结消瘿方组大鼠TGAb和TPOAb较雷公藤治疗组无显著。值得注意的是，TGAb和TPOAb主要对于自身免疫性甲状腺炎的诊断有重要意义，但并不是判断疾病好转的惟一指标，在临床上也观察到部分患者疾病的控制和好转与TGAb和TPOAb的下降并不是呈绝对相关性，本试验说明结果散结消瘿方及雷公藤可以抑制自身免疫性甲状腺炎的自身抗体形成的体液免疫应答。

3.2 TGAb和TPOAb的特征及致病机制 TGAb和TPOAb是自身免疫性甲状腺炎的特征性和标志性自身抗体［10］，其形成主要与T淋巴细胞的免疫缺陷有关。淋巴细胞分为辅助性T淋巴细胞 (Th)和抑制性T淋巴细胞 (Ts)，由于正常Ts活性不足，抗原TG和甲状腺过氧化物酶 (TPO)刺激B淋巴细胞产生自身抗体 (TGAb和TPOAb)，形成免疫复合物来对甲状腺细胞发挥损伤作用。甲状腺球蛋白是一种相对分子质量为660kD的球状同源二聚体糖蛋白，含有两个主要和一个次要的自身抗体结合位点，其抗体 TGAb包括 IgG1、IgG2、IgG3、IgG44个亚类，以IgG1和IgG4占优势，以IgG2功能活性最高［11］，但若有高水平的IgG2、IgG4亚型出现则提示有发展为甲状腺功能减退的倾向［12］，高滴度的TGAb与甲状腺有纤维性病变关系密切。TGAb可加重对非显性T细胞抗原决定簇自身免疫反应的扩大，从而导致自身免疫性甲状腺炎的发生及恶化。TPO是一种分子质量为100～105kD的膜结合蛋白，是参与甲状腺激素合成的一种主要酶，其抗体甲状腺过氧化物酶抗体 (TPOAb)以IgG1及IgG4亚类为主。在自身免疫性甲状腺炎患者中存在既能结合TG也能结合TPO的双特异性自身抗体，它的产生可能是由于TPO与TG有同源性的抗原决定簇。TPOAb的致病作用包括:(1)ADCC。(2)补体依赖的细胞毒性作用 (CDC)。(3)TPO在甲状腺激素合成中起重要作用，散结消瘿方通过减少TGAb和TPOAb，来抑制自身免疫性甲状腺炎的免疫应答。

本实验中观察到，光镜下正常组大鼠甲状腺见少量滤泡上皮细胞，背景胶质丰富，呈浓稠片状分布，未见巨噬细胞和淋巴细胞，上皮细胞未见嗜酸性改变。而模型组间质内见广泛淋巴浸润，滤泡上皮嗜酸性变，并见淋巴组织分布于小叶内及小叶周边，形成具有生发中心的淋巴小结。甲状腺滤泡明显减少，呈散在分布，甲状腺滤泡上皮细胞变性、破坏，类胶质减少。而雷公藤组、散节消瘿方组间质内淋巴浸润较模型组显著减少，小叶内及小叶周边形成具有生发中心的淋巴滤泡较模型组也减少。滤泡上皮嗜酸性变较模型组颜色浅，而散结消瘿方组淋巴细胞浸润较雷公藤组明显减少，说明散结消瘿方能减少自身免疫性甲状腺炎的炎性细胞浸润，从病理上有效抑制炎性反应的发生。

散结消瘿方对减少自身免疫性甲状腺炎的炎性反应、自身抗体的形成以及减小肿大的甲状腺疗效均优于雷公藤，推测散结消瘿方通过活血通络、消瘿化结可以软化肿大的甲状腺，减轻气、痰、瘀在颈下的交阻，通过大量破血、活血药的相互搭配可以有效控制自身免疫反应对甲状腺组织的损害。从组方上看，散结消瘿方由蜣螂虫、莪术、三棱、土贝母、瓦楞子、郁金、猫爪草、柴胡组成;方中蜣螂虫破瘀、攻毒、消癥，为方中君药，莪术、三棱共同配伍破血化瘀、专治顽癖癥瘕结块，苦能泄而辛能散，甘能和而入脾，血属阴而有形，所以相互配伍能治一切凝结停滞有形之坚积，对于自身免疫性甲状腺炎患者的颈下结节、肿块，或伴局部疼痛等症起到活血化瘀、缩小瘿结的作用，土贝母清热化痰，散结解毒，主治痰核、瘰疬等因痰所致诸疾。猫爪草具有清热解毒、软坚化痰、散结消肿功效，善治颈上瘰疬结核。土贝母、猫爪草起祛痰散结的作用。瓦楞子软坚散瘀，消积除痰，治疗痰积、瘿瘤、瘰疬、痰核，用于顽痰、癥瘕等证。郁金善治肝郁气滞血瘀所致的胸胁胀痛等证，善于疏肝理气，郁金、土贝母、瓦楞子、猫爪草配伍，共化瘿病之痰血瘀阻，为方中佐药。柴胡苦平而微寒，能除热散结而解表，故能愈以上诸病，为方中使药，是少阳、厥阴的引经之药。现代药理表明，柴胡有解热、镇痛、抗炎的作用，其成分柴胡多糖有提高细胞和体液免疫功能，抑制T淋巴细胞受体的生成，有免疫抑制的作用，配伍郁金能疏解肝郁，理气散结。全方药物配伍共奏理气、活血、散结之效。温肾健脾方有温补脾肾功能，肾乃先天之本，脾乃后天气血化生之源，脾肾和免疫功能息息相关，脾肾功能调和，则全身气血生化有源，免疫力强，本实验证实了散结消瘿方可以抑制节自身免疫性甲状腺炎大鼠体液免疫应答，减轻自身抗体的ADCC及炎症反应。

散结消瘿方能活血通络，消瘿化结，主治痰血互结甲状腺肿大，能减少甲状腺自身抗体 (TGAb、TPOAb)的形成，减少淋巴细胞的浸润，减轻自身免疫性甲状腺炎的自身免疫反应及炎症反应，且能缩小弥漫性肿大的甲状腺组织。

1 刘建文.药理实验方法学 ［M］.北京:化学工业出版社，2007，2:175.

2 吕延杰.药理学实验指导 ［M］.北京:人民卫生出版社，2008，4:17－19.

3 秦川.医学实验动物学 ［M］.北京:人民卫生出版，2008:415－416.

4 王坚，王扬天.自身免疫性甲状腺疾病发病机制研究进展 ［J］.医学研究生学报，2001，14(5):441－443.

5 Ajjan RA，Weetman AP.Pathogenesis of autoimmune thyroid disease.//Paul S.Contemporary immunology:auto－ immune reactions［M］.Humana Press Inc，Totowa，NJ，1999:31－59.

6 Xie LD，Gao Y.Distribution of immunoglobulin G subclasses of antithyroid peroxidase antibody in sera from patients with Hashimoto's thyroiditis with different thyroid functional status ［J］.Clin Exp Immunol，2008，154(2):172－176.