激活性KIR受体在HLA全相合无关供体异基因造血干细胞移植中的作用

金正明 何军 鲍晓晶 吴小津 孙爱宁 袁晓妮 李杨 徐超 吴德沛

自然杀伤(natural killer，NK)细胞是异基因造血干细胞移植后最早迅速重建的一群免疫细胞，NK细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR)的异源反应活性在造血干细胞移植中的作用至关重要。在KIR /人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)受配体错配模式的造血干细胞移植中，通过激活性KIR和抑制性KIR的相互作用使供者的NK细胞发生异源反应活性，攻击宿主白血病细胞，介导移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)效应，降低移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生[1-2]。本课题前期研究了无关供体异基因造血干细胞移植中抑制性KIR的意义[3-4]，而本文着重探讨激活性KIR受体在无关供体异基因造血干细胞移植中的作用。

材料与方法

一、材料

2006年1月至2007年12月来自中国造血干细胞捐献者资料库(Chinese Marrow Donor Program，CMDP)HLA高分辨定点实验室提供的 HLA-A、B、Cw、DRB1和 DQB1高 分 辨 全相合的供受者共74对，按照白血病分型，其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)32例、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)22例、慢性粒细胞白血病 (chronic myelogenous leukemia，CML)20例。74对供受者中有38对进行了移植并有移植后的随访结果，白血病分型ALL 18例、AML 12例、CML 8例。男27例，女11例，年龄4～45岁，平均27.2岁，其中4～19岁16例。移植术后患者随访到2008年12月。

二、实验方法

1. KIR基因分型方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)基因分型。扩增条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸 90 s，30 个循环。

2. KIR单体型分型：(1)A单体型：以抑制性KIR为主，仅有唯一的激活性KIR为KIR2DS4，KIR2DS4可进一步分为2DS4*001/002和2DS4*003-007两 组 亚 型；(2)B单体型：包含多种 激活性 KIR(KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1)的不同组合。

3. 激活性KIR的实验分组：由CMDP提供的74对供受者按照供者激活性KIR基因的数目，分为激活性KIR数目< 3个和≥3个2组。

4. 仪器：3130XL基因测序仪，Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪，Ultra-Volet Products紫外凝胶成像仪。

5. 移植预处理方案和预防GVHD方案：改良BU/CY为移植预处理方案；CSA+MTX (d1，d3，d6，d11)+MMF+ATG为预防GVHD方案。

三、统计学分析

应用SPSS 15.0进行统计学处理，各类基因检测结果用相对数表示，并用Kaplan-Meier法进行生存率分析，以P< 0.05为有统计学意义。

结 果

一、激活性KIR基因在个体中的阳性比例

在CMDP74对供受者中，48对供受者有 KIR2DS1基 因 (64.87﹪)；33对供受者有KIR2DS2基因(44.60﹪)；26对供受者有KIR2DS3基因 (35.14﹪)；74对供受者有 KIR2DS4基因 (100.00﹪)；34对供受者有KIR2DS5基 因(45.95﹪)；45对供受者有KIR3DS1基因(60.81﹪)(图1)。

图1 不同激活性KIR基因在供受者中的阳性比例

二、供受者中的KIR基因单体分型在白血病分型中的分布

1.在供受者KIR基因单体型A中，9对为ALL、6对为AML、5对为CML。

2.在供受者KIR基因单体型B中，GVH方向(供者为KIR单体型B)：11对为ALL、15对为AML、9对为CML；HVG方向(受者为KIR单体型 B)：12对为 ALL、1对为 AML、6对为CML。在不同白血病分型中，B组激活性KIR的多态性较多，在AML分型中供者有KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因的比例明显升高；在CML分型中供者有KIR2DS1和KIR3DS1基因的比例明显升高；在ALL分型中供者有KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因的比例明显降低(表1)。

表1 激活性KIR基因在不同白血病分型中的供受者分布情况(例)

三、在不同白血病分型中供受者激活性KIR的组合

GVH方向的KIR错配模式中供者中有各种激活性KIR组合的比例高于受者，且以2～3种组合的激活性KIR为主(表2)。

四、KIR单体型A中激活性KIR2DS4亚型与移植术后的生存分析

1.在CMDP提供的74对供受者中100.0﹪的个体表达KIR2DS4，其中51.4﹪仅表达2DS4*001/002亚 型，23.6﹪ 仅 表达 2DS4*003-007亚 型，25.0﹪ 同 时 具 有 2DS4*001-002与2DS4*003-007亚型(图2)。

图2 KIR 单体型A中KIR2DS4的不同基因亚型

2.在CMDP提供的74对供受者中38例接受了全相合无关供者造血干细胞移植，其中有9例供受者均为KIR单体型A，3例为供受者KIR2DS4相同，仅具有2DS4*001/002基因亚型均在移植术后死亡，6例患者的2DS4与供者不完全一样且供者均有2DS4*003-007基因亚型表达，除1例移植术后早期死亡以外，其余5例为1年后无病生存，生存率为83.3﹪(表3)。

表2 在不同白血病分型中的供受者激活性KIR基因的组合情况

表3 在KIR单体型A中供受者2DS4基因亚型的比较

五、在CMDP提供的74对供受者KIR单体型B中激活性KIR分析

在KIR单体型B中供者具有不同数量的激活性KIR受体(1～6个)，其中接受移植的38例患者1年生存率与不同的白血病分型相关：CML和AML患者中，当供者有≥3个激活性KIR时1年生存率为42.86﹪(6/14)，当供者激活性KIR< 3个时1年生存率为83.33﹪(5/6)；而在ALL患者中则呈相反趋势，当供者有≥3个激活性KIR时为87.50﹪(7/8)，当供者aKIR < 3个时为50.0﹪(5/10)(图3，4)。

图3 当供者激活性KIR < 3(n = 6)和激活性KIR≥3(n = 14)时，AML/CML患 者Kaplan-Meier生存曲线

图4 当供者激活性KIR < 3(n = 10)和激活性KIR≥3(n = 8)时，ALL患者Kaplan-Meier生存曲线

讨 论

NK细胞固有的免疫系统是通过NK细胞表面受体KIR和组织相容性分子及激活性和抑制性KIR的平衡来调节的[5]。当供者抑制性KIR受体缺失受者HLA-I类配体，阻抑信号解除，激活性KIR，随着表达此抑制性KIR的NK细胞比例上升，更多传递活化信号激活供者来源NK细胞的抑制性KIR发挥异源反应活性[6]。本实验结果表明，AML和CML移植的供者中激活性KIR2DS1和KIR3DS1基因的表达最高；激活性KIR2DS3基因在AML移植中供者的表达远高于受者；而在ALL移植中供者的表达远低于受者。在前期研究中已表明：72.73﹪供者表达KIR2DL1，57.14﹪供者表达 KIR3DL2，25.97﹪供者表达KIR3DL1[4]。因此，本研究提示：通过激活性KIR2DS1和KIR3DS1的过度激活抑制性KIR2DL1和KIR3DL1的表达，引发NK细胞的异源反应活性，攻击残留的白血病细胞而发挥GVL效应。

近年来国外对激活性KIR的研究一直是很片面的，供体激活性KIR的类型及表达高低无论是对无关供体还是单倍体的造血干细胞移植影响一直存在争议[7]。Clausen等[6]学者在无关供者造血干细胞移植的研究中表明，若供者携带KIR2DS2基因，GvHD发生率及复发率较高、总生存率和无病生存率较低，不携带此基因总生存率和无病生存率均为92﹪。Kroger等[8]报道：在无关供体的造血干细胞移植中，供体激活性KIR的基因低表达或激活性KIR基因类型少，可预防复发，改善无病生存率。本研究初步揭示：在ALL类型的移植中，供者携带激活性KIR的基因类型多，引起GVHD发生率高，但1年生存率也高(为87.50﹪)；而在CML和AML类型的移植中，供者携带激活性KIR的基因类型少，GVHD发生程度较轻，1年生存率为83.33﹪。因此，供者携带激活性KIR基因数目及表达因疾病类型不同而对造血干细胞移植效果的影响也存在差异。供者激活性KIR数量少是ALL影响预后的不利因素，而对AML/CML生存率高。由于样本量小作生存分析虽然差异没有统计学意义，但有此趋势应积累更多病例深入研究。

在KIR单体型A中仅有惟一的活化性受体KIR2DS4，单体型B有多种活化型受体的不同组合[9]。本实验发现：在无关供者全相合移植中供受者均为单体型A时，双方同时为2DS4*001/002纯合移植预后较差，而供者具有2DS4*003-007时预后良好，推测2DS4*003-007是主要引起NK细胞异源活性的KIR2DS4基因亚型，有此区别的原因还不明了。Hou等[10]研究表明，在无关供体的造血干细胞移植中激活的KIR2DS4基因序列的差异，决定移植后GVHD的发生，因此，有待进行深入研究。

综上所述，本研究认为，供受者的KIR单体型、激活性KIR基因亚型和数目在无关供体异基因造血干细胞移植中起关键的作用，对激活性KIR如何恰当的调节抑制性KIR的表达引发NK细胞的异源反应，从而能降低GVHD发生而增强GVL效应，将是本课题今后的研究方向。

1 Ruggeri L, Capanni M, Mancusi A, et al. The impact of donor natural killer cell alloreactivity on allogeneic hematopoietic transplantation[J]. Transpl Immunol, 2005,14(3): 203-206.

2 Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia:challenging its predictive value[J]. Blood, 2007, 110(1):433-440.

3 何军, 陈子兴, 侯建全, 等. HLA-Cw基因的高分辨分型在造血干细胞移植中的意义的初步探讨[J].中华微生物和免疫学杂志, 2007, 27(7):643-646.

4 鲍晓晶, 何军, 陈子兴, 等. 非亲缘性HLA全相合的造血干细胞移植中供者-受者NK细胞KIR受体的研究[J].中华血液学杂志, 2007, 28(8):510-513.

5 Mei H, Margarita Fa, Yuhong G, et al. Natural killer cell crossmatch: Functional analysis of inhibitory killer immunoglobulin-like receptors and their HLA ligands[J].Human Immunology, 2007, 68(6):507-513.

6 Clausen J, Wolf D, Petzer AL, et al. Impact of natural killer cell dose and donor killer-cell Immunoglobulinlike receptor(KIR) genotype on outcome following human leucocyte antigen-identical haematopoietic stem cell transplantation[J]. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 148(3):520-528.

7 Chiossone L, Vitale C, Cottalasso F, et al. Molecular analysis of the ethylprednisolone-mediated inhibition of NK-cell function: evidence for different susceptibility of IL-2– versus IL-15–activated NK cells[J]. Blood, 2007,109(9): 3767-3775.

8 Kroger N, Binder T, Zabelina T, et al. Low number of donor activating killer immunoglobulin-like receptors(KIR) genes but not KIR-ligand mismatch prevents relapse and improves disease-free survival in leukemia patients after in vivo T-cell depleted unrelated stem cell transplantation[J]. Transplantation, 2006, 82(8):1024-1030.

9 黎琉光, 王春燕. 自然杀伤细胞激活性和抑制性受体及其配体的研究进展[J].国外医学内科学分册,2006, 33(1):10-13.

10 Hou LH, Steiner NK, Chen M, et al. KIR2DL1 allelic diversity:four new alleles characterized in a bone marrow transplant population and three families[J].Tissue Antigens, 2007, 69(3):250-254.