3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中G蛋白偶联受体48的表达研究

孙海燕 彭永德 董维平 王煜非 范能光 刘瑞 赵立 丁晓颖

肥胖是由脂肪细胞的数量增多和体积增大所致，而脂肪细胞的增多是由于前脂肪细胞不断分化所引起，近年来脂肪细胞的分化调控已成为肥胖及其相关疾病的研究热点。

前期研究结果提示G蛋白偶联受体48（G protein coupled receptor 48，GPR48）基因敲除小鼠脂肪组织含量明显减少，但该受体参与脂肪细胞的增殖与分化机制不明[1]。过氧化物酶体增殖体激活受体g2（peroxisome proliferatoractivated receptorγ2，PPARg2）和 CCAAT 增强子结合蛋白（CCAAT Enhancer binding protein CEBP α，C/EBPα）是调节脂肪形成的主要转录因子，在脂肪细胞分化中起着决定性作用[2-4]。因此探讨GPR48与核转录因子在脂肪细胞分化过程的表达及调控关系具有重要意义。

本研究观察前体脂肪细胞分化过程中GPR48、PPARγ2和C/EBPα的表达水平变化，探讨GPR48参与脂肪细胞分化过程及其与转录因子调控机制的关系。

材料与方法

一、材料

小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）株，购自中国科学院上海细胞研究所。高糖Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，地塞米松和1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）（美国Sigma公司），合成人胰岛素（美国礼来公司），逆转录一聚合酶链反应试剂盒（美国promega公司），SYBR Green PCR master mix(日本Takara公司 )，Trizol(美国Invitrogen公司)，荧光定量PCR仪器(美国Bio-Rad公司)。

二、方法

（一）3T3-L1前脂肪细胞的培养和诱导

将3T3-L1细胞接种在6孔培养板，在含10﹪胎牛血清和1﹪青链霉素的高糖DMEM培养液37℃、5﹪CO2培养，当细胞生长至融合，加细胞分化诱导A液（0.5 mmol/L IBMX、1 µmol/L地塞米松、10 µg/ml胰岛素），继续培养 48 h，更换培养液，加诱导B液（10 µg/ml胰岛素）培养48 h后更换培养液，以后每2 d更换培养液，分别在诱导前0 d和诱导后2、3、6、10和14 d收集细胞。

（二）总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取和Real-time PCR

按照Trizol说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，取2 μg RNA加入随机引物，反转录成cDNA。在荧光定量PCR仪器上进行扩增反应。PCR 反应体系：cDNA 2.0 μl，SYBR Green Master 10 μl，上 下 游 引 物（2.5 Μm）各 2 μl，用DEPC-H2O补足至20 μl体积。PCR反应条件：95℃ 5 min预变性，95℃15 s、60℃1 min，循环40次。融解曲线显示为单峰。应用2-△△Ct法进行相对定量分析。实验重复3次，每组设3孔重复（N = 3，n= 3）。引物由上海博尚生物工程技术服务公司合成，引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物

三、统计学分析

采用SPSS 11.0统计软件对实验结果进行统计分析。受体表达水平以±s表示。不同时间表达水平比较采用随机区组F检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3T3-L1前脂肪细胞分化前后形态变化

体外培养的3T3-L1前脂肪细胞在分化前呈梭形，无脂滴纤维母样细胞形态。诱导分化的第3～4天细胞变大变圆，部分细胞内出现脂滴，随着分化时间的延长细胞内脂滴富集，到诱导分化的1周左右，80﹪细胞呈成熟脂肪细胞形态，细胞呈圆形，胞浆中富含脂滴，围绕核周呈戒环样结构。（图1，2）

二、3T3-L1前脂肪细胞分化过程中GPR48、PPARγ2和C/EBPα的表达水平变化

图1 诱导分化前3T3-L1前脂肪细胞 (×100)

图2 诱导分化1周脂肪细胞 (×100)

比较前体脂肪细胞不同分化阶段GPR48表达水平变化，比较脂肪细胞分化标志基因PPARγ2和C/EBPα表达水平变化。由图3可知，与诱导前期相比，GPR48基因在诱导分化第2天表达显著上调，差异有统计学意义(t= 4.12，P= 0.015)，分化第3天仍较高表达，差异有显著统计学意义(t= 6.21，P= 0.003)。分化第6天至第14天下调，与分化前比较差异无统计学意义。图4结果显示，PPARγ2表达在诱导分化后明显上调，分化第6天达高峰，第10～14天持续处于较高水平，各时段表达水平与诱导前期相比差异均有统计学意义(t值在4.17～22.65间，P均 < 0.01)。图5结果显示，C/EBPα表达在诱导分化后明显上调，分化后第3天达高峰，第6～10天持续保持在较高水平，与诱导前期相比各时段表达水平差异均有统计学意义(t值在4.38～13.87间，P均< 0.01)，第14天趋于下调，与分化前比较差异无统计学意义（表2）。

图3 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中GPR48表达

图4 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中PPARγ2表达

图5 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中C/EBPα表达

讨 论

肥胖是冠心病、高血压、2型糖尿病及高脂血症等许多严重疾病的共同致病基础。肥胖的形成主要包括2个方面，脂肪细胞数量的增加和脂肪细胞体积增大。脂肪细胞分化是决定脂肪细胞体积数量的关键因素，脂肪分化调控也是研究肥胖及其相关疾病发生机制的热点问题。3T3-L1前体脂肪细胞通过经典鸡尾酒诱导方案可以分化为脂肪细胞，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。PPARγ和C/EBPα是调节脂肪形成最主要的转录因子，它们调控着许多中间型转录因子[2-4]。

表2 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中PR48、PPARγ、C/EBPα的表达水平变化（±s）

表2 3T3-L1前脂肪细胞分化过程中PR48、PPARγ、C/EBPα的表达水平变化（±s）

注：与诱导前比较aP < 0.05

mRNA相对表达 诱导前 诱导第2天 诱导第3天 诱导第6天 诱导第10天 诱导第14天 F值 P值GPR48 1.01 ± 0.14 2.91 ± 0.78a 2.39 ± 0.36a 1.09 ± 0.28 1.28 ± 0.15 1.05 ± 0.23 13.2340.000 PPARγ 1.02 ± 0.2227.95 ± 2.32a265.11 ± 109.69a916.76 ± 79.23a233.00 ± 17.73a671.98 ± 67.31a104.3400.000 C/EBPα 1.00 ± 0.0658.21 ± 16.85a172.36 ± 21.39a 78.00 ± 14.36a 37.11 ± 2.78a 15.34 ± 21.39 48.2850.000

尽管PPARg2和C/EBPα对脂肪细胞分化的重要性已得到广泛认可，然而二者如何调控脂肪细胞分化的分子机制仍知之甚少。本研究数据显示PPARγ2和C/EBPα的表达在诱导分化后明显上调，以后持续保持在较高水平并趋于稳定。二者的表达与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。

GPR48是近年发现的G蛋白偶联受体家族中功能未知的孤儿受体，属于糖蛋白激素受体。近期对GPR48敲除小鼠研究均发现纯合敲除小鼠体型消瘦，腹腔网膜和性腺旁白色脂肪发育不良，脂肪组织含量明显减少，并伴有生育缺陷和围生期死亡[1,5]。GPR48在体内分布广泛，白色脂肪、棕色脂肪、肝脏、肌肉、性腺和肾上腺均有高丰度表达，这些组织对于机体的脂肪代谢和能量平衡意义重大。GPR48在脂肪组织高丰度表达，跨膜蛋白GPR48是否通过核转录因子PPARγ2参与脂肪细胞的增殖与分化机制，本研究数据提供了跨膜蛋白GPR48和转录因子PPARγ2、C/EBPα基因在脂肪细胞分化不同时期的表达，GPR48表达高峰出现于分化初期，早于转录因子PPARγ2、C/EBPα的表达高峰，GPR48可能在分化早期阶段参与调控脂肪细胞分化。

1 Li XY, Lu Y, Sun HY, et al. G protein-coupled receptor 48 upregulates estrogen receptor α expression via cAMP/PKA signaling in the male reproductive tract[J]. Development,2010, 137(1):151-157.

2 Odegaard JI, Ricardo-Gonzalez RR, Goforth MH, et al.Macrophage-specific PPARgamma controls alternative activation and improves insulin resistance[J]. Nature, 2007,447(7148):1116-1120.

3 Bai P, Houten SM, Huber A, et al. Peroxisome proliferatoractivated Receptor (PPAR)-2 controls adipocyte differentiation and adipose tissue function through the regulation of the activity of the retinoid X receptor/PPAR{gamma} heterodimer[J]. J Biol Chem, 2007,282(52):37738-37746.

4 Zuo Y, Qiang L, Farmer SR. Activation of CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) alpha expression by C/EBP beta during adipogenesis requires a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-associated repression of HDAC1 at the C/ebp alpha gene promoter [J].J Biol Chem, 2006, 281(12):7960-7967.

5 Tzameli I, Fang H, Ollero M, et al. Regulated production of a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand during an early phase of adipocyte differentiation in 3T3-L1 adipocytes [J]. J Biol Chem, 2004, 279(34):36093-36102.

6 Mazerbourg S, Bouley D, Sudo S, et al. Leucine-rich repeat-containing, G protein-coupled receptor 48 null mice exhibit intrauterine growth retardation associated with embryonic and perinatal lethality[J]. Mol Endocrinol,2004, 18(9):2241-2254.