肾移植受者单抗原磁珠法检测人类白细胞抗原DP抗体

邱建新 蔡俊超 Paul I. Terasaki

以往用MAILA法检测孕妇血清中的人类白细胞抗原DP（human leucocyte antigen-DP，HLADP）抗体，发现阳性率为9.7﹪，并与HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗原的反应高度相关[1]。用同样的方法，有7.3﹪等待肾移植的患者中也检测到HLA-DP抗体[2]。由于常常和其他HLA抗体连在一起，用常规的方法检测出HLA-DP抗体较为困难。目前最新的技术是将HLA-DP抗原包被到可用流式细胞仪检测的磁珠上，使HLA-DP抗体能与其他HLA抗体很清楚的区别并检测出来[3]。应用流式细胞检测方法，Young等已发现有12﹪等待移植的患者中可检测到HLA-DP抗体，45﹪的再次移植患者和13﹪非移植女性患者都有HLADP抗体，表明移植和怀孕可引起HLA-DP抗原的致敏。

对象与方法

一、对象

本研究323例被检患者中，有功能组138例，排斥组185例，来自以下4移植中心：（1） Bignon JD，法国，南特，HLA和组织相容性实验室；（2） Lee PC，台湾成功大学医学院 移植外科；（3） Rosenberg JC，美国，密歇根移植协会；（4） Miller J，美国，迈阿密大学医学院，外科移植部。

二、检测方法

HLA-Ⅰ类抗体检测系采用One Lambda公司的试剂，按照其操作手册用LABScreen PRA法检测，流式细胞单抗原磁珠检测按试剂盒操作说明进行，可检测HLA-DR、DQ和DP抗体。HLA-DP抗体的检测采用HLA-Ⅱ类4组流式磁 珠，包 括 DPw1(DP0101)、DPw2(DP0201)、DPw3(DP0301)、DPw4(DP0401)、DPw5(DP0501)和DPw11(DP1101)6种DP抗原。

取 5 µl 流式细胞单抗原磁珠与 20 µl 未稀释的血清培养 30 min，洗涤后加入100 µl经100倍稀释的荧光抗人体IgG（1:100稀释）培养30 min，经洗涤和固定后用流式细胞仪检测。使磁珠主要分布于 FSC vs SSC区域，同时通过标准的磁珠确定FL2 vs FL1的区域范围。磁珠是通过流式细胞仪的FL2频道来识别的，HLA 抗体的阳性反应的荧光强度是通过FL1频道来识别的。阴性窗口是通过阴性对照血清的FL2 vs FL1的区域范围来确定的，这个窗口是用来判断被检血清结果的[4]，如果检测出的磁珠位移到阴性窗口限定区域外则判定为阳性（图1）。

图1 DP0301抗体阳性的流式细胞结果，箭头即阳性抗体

三、统计学分析

采用SPSS 13.0对数据进行统计学分析，各类抗体的例数以相对数表示，功能组与排斥组抗体例数组间的差异检验采用卡方检验，以P< 0.05为有统计学意义。

结 果

在138例有功能组的肾移植患者血清中5.1﹪检测到HLA-DP抗体，而排斥组的185例患者血清中有 19.5﹪检测到 DP 抗体（c2=14.176，P= 0.000，表1)。在138例有功能组患者中，12.3﹪和8.7﹪的患者有HLA-Ⅰ类和DR/DQ抗体，而排斥组中有39.5﹪和48.6﹪的患者有同样的抗体（c2=28.966，P= 0.000；c2=58.393，P= 0.000）。

表1 有功能组与排斥组 HLA-DP 抗体阳性患者比较

HLA-Ⅰ类和DR/DQ抗体与DP抗体的关系如表2所示，HLA-DP抗体在排斥组与DR/DQ抗体的关系更为密切。总体来说，在有功能组和排斥组中分别有42.9﹪（3/7）和63.9﹪（23/36）的HLA-DP阳性患者有DR/DQ抗体。在HLA-Ⅰ类和DR/DQ都阴性的患者中，在有功能组和排斥组分别有3.5﹪和13﹪的患者有DP抗体（P< 0.05）。

与HLA-Ⅰ类抗体和DR/DQ抗体一样，比起有功能组来，排斥组能检测到更多的HLA-DP抗体。更重要的是，本研究发现即使在HLA-Ⅰ类和DR/DQ抗体都阴性的患者中，排斥组的HLADP抗体仍比有功能组明显要高，提示HLA-DP抗体可不依赖其他HLA抗体而独立产生。

讨 论

最近，Nelson等[5]报告了 4例 HLA-DR、DQ零错配（3例同时HLA-A、B、C零错配）的患者由HLA-DP抗体引起的体液性排斥反应，这些患者移植前供体B细胞的流式交叉配型均为阳性，虽然其中2例经治疗后逆转，但移植肾的生存率还是受到明显影响，得出结论HLA-DP抗体和急性血管性排斥反应明显有关，即使在A、B、DR零错配的患者中，B细胞交叉发应阳性也应引起重视。

当第1次移植物被排斥掉后HLA-DP抗体的增加，可以解释HLA-DP位点的错配而造成的。而对再次移植，首次移植后所产生HLA-DP抗体会攻击再次移植物[6]。由于绝大部分受体和供体并不作DP配型，如果能很好地作HLA-DP抗原的组织配型，有HLA-DP抗原的供体移植给有HLA-DP抗体的受体是可以避免的。由于阳性的B细胞交叉配型并不一定导致超急性排斥反应，所以常常被忽略[7]。应用更为敏感的B细胞交叉配型方法，虽然可能出现检测背景过高的问题，但仍可提高HLA-DP抗体检出率。HLA-DP抗体可出现于已排斥掉一个移植物的再次移植，也提示对于再次移植，避免阳性的B细胞交叉配型是非常重要的。HLA-DP抗原按其结构来说属于HLA-Ⅱ类抗原，但它并不是与肾移植配型的抗原（DR和DQ）紧密相连的[8]，所以即使在A、B、DR均相配的患者中也可出现HLA-DP错配，因此即使都是零错配的移植也应列出HLA-DP的抗体。

虽然HLA-DP抗原有超过100个的等位基因，本研究用的6个等位基因几乎涵盖了美国[9]和法国人群[10]的70﹪～80﹪。在这些等位基因中，最多见的是DP0301，其次是DP0501和DP0401（图2）。从抗原的分布频率来说，美国[9]和法国[10]的人群分布应该能检测到更多的DP0401，而非DP0301，说明了DP0301具有更强的抗原性。所以本研究得出结论：在一个移植肾被排斥掉以后，能产生很多的HLA-DP抗体，因此对于再次移植，应作DP的组织配型以避免DP等位基因致敏的存在。

图2  HLA-DP抗体的频率分布

表2 HLA-DP 抗体和 HLA-Ⅰ类及 DR/DQ 抗体的关系

1 Mueller-Eckhardt G, Kiefel V, Tlusty A, et al.Incidence and specificity of HLA-DP antibodies in pregnancy sera[J].Hum Immunol,1990,29(3):166-174.

2 Pfeiffer K, Vogeler U, Albrecht KH, et al. HLA-DP antibodies in patients awaiting renal transplantation[J].Transpl Int,1995,8(3):180-184.

3 Pei R, Lee JH, Shih NJ,et al. Single human leukocyte antigen flow cytometry beads for accurate identification of human leukocyte antigen antibody specificities[J].Transplantation,2003,75(1): 43-49.

4 Arnold ML, Pei R, Spriewald B, et al. Anti-HLA class II antibodies in kidney retransplant patients[J]. Tissue Antigens,2005,65(4): 370-378.

5 Nelson KA, Youngs D, Marks MH, et al. Acute humoral rejection is associated with antibodies to HLA-DP (Abstract)[J]. Am J Transplant, 2005,5(Suppl 11): 245.

6 Mytilineos J, Deufel A, Opelz G. Clinical relevance of HLA-DPB locus matching for cadaver kidney retransplants:a report of the collaborative transplant study[J]. Transplantation, 1997, 63(9):1351-1354.

7 Le Bas-Bernardet S, Hourmant M, Valentin N, et al.Identification of the antibodies involved in B-cell crossmatch positivity in renal transplantation[J].Transplantation, 2003,75(4): 477-482.

8 Baisch JM, Capra JD. Linkage disequilibrium within the HLA complex does not extend into HLA-DP[J]. Scand J Immunol,1993, 37(4): 499-503.

9 Hsia S. Population studies: Caucasian US normal. In:Terasaki PI, Gjertson DW eds. HLA 1997. Los Angeles,CA: UCLA Tissue Typing Laboratory, 1997: 336.

10 Begovich A. HLA-DPA1, -DPB1, -DQA1 and DQB1 allele frequencies in a population from France (CEPH)[J]. Hum Immunol, 2004,65(9-10):935.