氧化铁标记神经干细胞对大鼠放射性脑损伤的磁共振成像研究

白守民 薛卫平 刘宜敏 毕卓菲 梁碧玲

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是目前治疗放射性脑损伤最有希望的方法之一。很多学者报道了用NSCs治疗脑缺血、脑梗塞等，取得了一定的疗效。NSCs治疗放射性脑损伤是个复杂的过程，很多机理尚不清楚。其中，NSCs进入脑组织后在脑内的迁移，定向到达损伤部位，是干细胞治疗脑损伤的基础。本研究用SPIO标记NSCs，磁共振（magnetic resonance，MR）活体示踪干细胞在大鼠脑内的迁移。

材料与方法

一、实验动物、试剂及仪器

雄性健康（Sprague Dawley，SD）大鼠 30只，体重200 g。超顺磁性氧化铁纳米颗粒SPIO(德国 Schering 公司，1.4 ml /支，含铁浓度0.5 mmol/ml，铁颗粒直径60 nm)；立体定位仪（深圳瑞沃德公司68001单臂型）；模拟定位机（东芝公司）；Siemens Primus直线加速器（西门子公司）；CO2培养箱（德国贺利氏公司）；倒置相差显微镜；Philips Intera 1.5T MR扫描仪；大鼠专用线圈（上海辰光公司）；NSCs完全培养基（广州金叶公司）。

二、NSCs的培养及鉴定

断颈处死SD母鼠，75﹪酒精浸泡数分钟，用眼科剪在腹部的中间位置横切，剪开腹部皮肤，充分暴露母鼠的腹膜，剪开腹膜，可见胎鼠。将胎鼠逐个分离出来，并转移到另外一个装有磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）的培养皿中，在解剖显微镜下无菌去除脑膜，分离胎脑，将分离出来的胎脑移入装有NSCs完全培养基的离心管中，吹打，直至胎脑解离成单细胞悬液。将解离好的单细胞悬液移入T25培养瓶中，一个胎脑接种一个T25培养瓶，将T25培养瓶放回37℃ CO2培养箱中。当NSCs出现神经球较大和NSCs出现贴壁分化的情况后，再对NSCs进行传代培养。

NSCs nestin抗原表达鉴定：吸取少量细胞悬液滴于晶多聚赖氨酸包被的载玻片上，培养2 h，使细胞黏附于载玻片上。用4﹪多聚甲醛+ 0.3﹪戊二醛固定15 min，计2次，5﹪正常山羊血清的PBS（含0.1﹪ Triton X-100）在37℃孵育30 min进行封闭，吸去封闭液，加抗nestin多克隆抗体（1:200），4℃过夜。PBS漂洗3次，各 10 min，加二抗（1:500，山羊抗兔），37℃孵育45 min，吸去二抗反应液，PBS漂洗3次，加染核试剂 Hochest，室温孵育 30 min，PBS 洗 3次，荧光显微镜下观测结果[1]。

三、放射性半脑损伤模型的制作

在模拟定位机下拍摄大鼠正位及侧位照片，用不规则低熔点铅制作右半脑照射的电子线挡块及后半脑照射的光子线挡块。电子线半脑模型采用6 Mev电子线垂直照射，源皮距100 cm，剂量率为300 Mu/min，照射深度为1.5 cm。光子线后半脑模型采用6 MV光子线侧位照射，源皮距60 cm，照射深度为2.5 cm，体表加1 cm补偿。取体重200 g的SD大鼠30只分为3组，10﹪的水合氯醛0.37 ml/100g麻醉大鼠，固定后行放疗，第1组12只行电子线半脑照射，剂量为30 Gy；第2组12只行光子线后半脑照射，剂量为45Gy；第3组6只行光子线后半脑照射，剂量为55 Gy。

四、NSCs的体外标记

硫酸鱼精蛋白（PRO）为10 mg/ml，用蒸馏水稀释为1 mg/ml备用。抽取30 μl的SPIO原液加入无血清培养液里，稀释后备用，在24孔板中，取5孔先加入无血清培养液0.5 ml，按终体积为2 ml，预先加入总量PRO及不同体积的SPIO，使PRO 的终浓度为 4 μg/ml，在 37℃、5﹪CO2及饱和湿度的CO2培养箱中共同孵化过夜。12 h后，分别消化、离心各孔细胞备用。

五、NSCs的立体定向移植

同时获取6瓶2代NSCs，计数后备用。按总体积5 ml在24孔板中，加入PRO及SPIO，使终浓度达到 PRO 为 4 μg/ml，SPIO 为 100 μg/ml。12 h后，分别消化、离心各瓶细胞，最后收集细胞，按5 × 105/10 μl备用。在放射性大鼠半脑损伤模型制作后7 h，各组大鼠麻醉后固定于大鼠立体定位仪上。根据大鼠脑立体定位图谱，以双耳间线中点为0位。第1组，6只用右半脑照射大鼠，行左半脑移植，在大鼠左侧半脑钻孔（向前8.5 mm，左3 mm，深度5 mm），微量注射器注入细胞。第2组6只用后半脑45 Gy照射大鼠，在左前脑定位注入细胞。第3组6只用后半脑55 Gy照射大鼠，在左前脑定位。第4组6只用右半脑照射大鼠，为第1组对照组，植入未标记SPIO的NSCs。第5组6只用后半脑45 Gy放射大鼠，为第2、3组对照组，注射未标记SPIO的NSCs，每个大鼠植入的细胞数为5×105个细胞，体积为10 μl，用微量注射器抽取细胞后，按定位仪位置进针，缓慢注入细胞，注射时间> 5 min，注射后留针5 min，缓慢拔针。

六、磁共振扫描成像

在移植后第 0、3、7、14、21和 27天进行大鼠脑MR扫描。MR检查序列：SE T1WI横断位、TSE T2WI横断位及矢状位成像。T1WI的参数：TR/TE/采集次数(NSA)：300 ms/15 ms/1，层厚：2.0 mm；Vox 0.3 × 0.5。T2WI：TR/TE/采集次数(NSA)：1600 ms/50 ms/1，层 厚：2.0 mm；Vox：0.4 × 0.4；矩阵：512 × 512。

七、组织病理学及普鲁士蓝染色

分别在MR成像各时间点，各组取1只大鼠，取全脑行病理检查。大鼠过量麻醉后，开胸，将灌洗针头通过左心室插入升主动脉，用500 ml生理盐水、500 ml中性甲醛灌注后开颅取脑，石蜡包埋、切片，左半脑移植采用失状位切片，后半脑移植采用冠状位切片。常规苏木精—伊红染色及普鲁士蓝染色，光镜下观察标记细胞的分布。

结 果

一、NSCs的培养及鉴定

最初培养的原代细胞大部分细胞呈球形聚集生长，但细胞不均一，有较多单个散在细胞及絮状组织。

传代后的NSCs仍呈球形悬浮生长，但杂细胞较少，背景较纯，细胞球光亮透明，一般细胞传至第二代即可用于实验研究。

NSCs nestin抗原表达鉴定结果显示，nestin表达阳性，说明该细胞符合NSCs的抗原特性。

二、大鼠放射性脑损伤模型的制作及立体定向移植

成功构建大鼠左半脑及后半脑放射性脑损伤模型，30只大鼠无1例死亡。全部大鼠均顺利移植，其中2只第2天出现脑膜炎症状死亡。全部大鼠在移植当天开始使用头孢呋辛钠100 mg/只腹腔注射，连用3 d。

三、磁共振成像

在移植术后不同时间MR检查的结果如下图，1.5T MR可以清晰显示大鼠脑内植入的干细胞范围，成像可以持续1个月以上。后半脑放射大鼠模型中，55 Gy放疗组移植术后7 d就看到针孔局部向后突出的低信号影，移植术后14 d仍比较明显（图1 ）。右半脑放射大鼠模型中，移植术后27 d可以看到针孔局部向左侧突出的低信号影（图2）。

图1 光子线剂量为55Gy，前半脑移植后第0、7、14天情况

图2 光子线剂量为30Gy，右半脑照射移植后第1、12、27天照射情况

四、病理学检查

不同时间大鼠经组织切片及普鲁士蓝染色后，图3显示移植第14天，铁标记的细胞在脑组织内存活，部分细胞向周边扩散。图4显示移植后第27天，在疏松的组织间隙可以看到少量分布的铁标记细胞。

图3 光子线剂量为55Gy大鼠移植后第14天（×200） 

图4 光子线剂量为55Gy大鼠第27天组织间隙标记（×200）

讨 论

将SPIO标记的干细胞移植到活体内，观察干细胞在体内的迁移已进行了很多研究。正常情况下，干细胞移植到大鼠脑皮质，细胞迁移很少或不迁移，Zhang等[2]将细胞注入到正常大鼠纹状体后28 d，发现细胞仅移动1～1.5 mm。Jendelova等[3]没发现移植的细胞在正常大鼠脑内的迁移，但在脑损伤发生时，移植的干细胞会表现出向损伤部位移动的趋化性。脑缺血实验中，Hoehn等[4]以SPIO标记的胚胎干细胞移植入大鼠脑缺血对侧半球的皮质下区和纹状体，移植部位最初在MRI上是1个圆形的低信号区，数天后移植区内侧的胼胝体出现了线状的低信号影，表明干细胞在向损伤侧迁徙。在另一只鼠脑的3DMRI重建图象上，明显的看出干细胞于胼胝体内由移植区向缺血半球迁徙。进一步的研究现，干细胞的低密度影沿脑室壁呈线状环绕，并向缺血半球侧脑室的脉络丛聚集，经过纹状体，最后到达缺血半球的皮层。本研究中，建立左右半脑及前后半脑的放射损伤模型，结果发现，移植后4周，移植入未放射左半脑的NSCs有向经过放射的右半脑迁移的趋势，注射针孔局部出现向右的低信号影。后半脑放射模型中，在前半脑注射干细胞后，MR也可以显示注射部位局部有向后的低信号影，说明干细胞也有向后移动的趋势。55 Gy放射大鼠在移植后7 d就发现向后的低信号影，而45 Gy放射大鼠在27 d才发现向后的低信号影，似乎向后移动的趋势出现的时间与放射剂量相关，但还需要更多例数进一步证明。本研究病理结果也发现干细胞向组织迁移的趋势，在针孔附近，靠近放射区域的疏松组织间隙可以发现少量的标记细胞，但由于本单位实验条件限制，实验中很难将MR显示迁移的部位在病理组织中准确切片。另外，干细胞在脑内移动细胞的数量及距离，以及干细胞在脑组织内的分化，还有待进一步更精确的研究。SPIO示踪NSCs在活体的迁移，为进一步研究干细胞在微环境下的存活分化及治疗机理提供了有益的帮助。

干细胞在体内的趋化性及干细胞治疗组织损伤的机制尚不完全清楚。大鼠放射性脑损伤模型的建立，目前没有标准的方法，主要原因是大鼠脑对放射线耐受性较高，多数研究表明，25～30 Gy单次全脑大剂量放疗后，一个月内，大鼠基本无明显放射性脑病的症状，病理检查也没有明显的炎性改变[5]。但MRS可以在早期发现脑内代谢的改变，Movsas和官健等[6-7]的研究表明，放疗后2周，MRS N-乙酰天门冬氨酸就出现了明显的降低，说明在放射治疗后，在脑超微结构发生变化之前，脑内的代谢已经出现异常改变。本研究在放疗后1周植入干细胞，高剂量组植入1周时就发现干细胞的迁移，证明在放疗后早期，大鼠脑内就出现了炎性因子，引起干细胞的趋化作用，结果同MRS的研究基本一致。干细胞治疗损伤的主要机理在于减少炎性因子分泌，稳定溶酶体膜及减少凋亡等，如果损伤早期应用干细胞治疗是否能减少炎性因子分泌从而可以减少损伤程度，延长出现损伤的时间，将是我们进一步研究的内容。

1 Pluchino S, Zanotti L, Rossi B, et al. Neurospherederived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism[J]. Nature, 2005,436(7048):266-271.

2 Zhang RL, Zhang L, Zhang ZG, et al. Migration and differentiation of adult rat subventricular zone progenitor cells transplanted into the adult rat striatum[J].Neuroscience, 2003, 116(2):373-382.

3 Jendelova P, Herynek V, DeCroos J, et al. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles[J]. Magn Reson Med,2003, 50(4):767-776.

4 Hoehn M, Kustermann E, Blank J, et al. Monitoring of implanted stem cellmigration in vivo:a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat[J]. Proc Natl Acad Sci 2002,99(25):16267-16272.

5 Chiang CS, McBride WH, Wither HR. Radiation-induced astrocytic and microglial responses in mouse brain[J].Radiother Oncol, 1993, 29(1):60-68.

6 Movsas B, Li BS, Babb JS. Quantifying radiation therapyinduced brain injury with whole-brain proton MR spectro scopy:initialobservations[J]. Radiology, 2001, 221(2):327-331.

7 官键,陈龙华,李志勇. 单次大剂量照射活体动物脑的放射区域代谢和超微结构的研究[J]. 实用放射学杂志 , 2007, 23(1):115-118.