温度和二氧化碳变化对大规模培养脐带间充质干细胞的影响

林娜 陈津 付云烽 施小华 王庆华 谭建明

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞。近年来，干细胞广泛应用于心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病和创伤等各种疾病的研究[1]。脐带来源广泛，取材方便，易于采集保存。脐带采集对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，脐带来源的间充质干细胞（umbilical cord derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs）已成为近年研究的新热点。在UC-MSCs细胞培养过程中，通过对同一根脐带分离出的脐带间充质干细胞，在不同开关箱次数情况下，P3代培养3 d，脐带间充质细胞形态观察和数量统计，相同细胞的生长速度和质量存在差异。本文主要探讨大规模培养MSCs 过程中频繁开关培养箱造成温度和CO2浓度的变化对细胞生长情况的影响，报道如下。

材料和方法

一、脐带来源

脐带取自福州总医院2009年9月至2010年9月健康足月产新生儿，病原学检查阴性，经产妇知情同意后无菌留取。

二、仪器试剂

CO2温培养箱 （日本，SANYO公司），LGDMEM培养基 (美国，Hyclone公司)，胎牛血清FBS(美国，Hyclone公司)，75 cm2培养瓶 （美国，Costar公司），0.25﹪胰酶(美国，Gibco公司)。

三、UC-MSCs 的分离与培养

取新鲜足月产新生儿脐带，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗，剔除动静脉，分离出沃顿胶，0.1﹪Ⅳ胶原酶消化过夜，0.25﹪胰酶消化60 min，离心洗涤，用含10﹪胎牛血清的LG-DMEM培养基接种，培养72 h换液，以后每3 d换液1次，长到80﹪融合时，用0.25﹪胰酶消化、传代。镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面抗原。

四、开关箱实验

取 P3代细胞，以 2×105/75 cm2的密度接种，分成7组，每组6瓶细胞，置于7个37℃、5﹪ CO2的培养箱中培养，对照组培养过程中不开关培养箱，其它6组分别模拟培养操作中不同的开关培养箱次数（每天5次、10次），以及每次不同的开箱时间（1、2和3 min）。第4天取出，倒置显微镜下观察细胞形态及密度分布，0.25﹪胰酶消化，600×g离心5 min，重悬计数，比较细胞增殖情况。

五、统计学分析

应用统计软件SPSS 13.0进行统计分析， 对照组和实验组细胞计数结果以± s的形式表示，各组间差异显著性检验采用单因素方差分析（ANOVA），以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞形态观察

镜下观察细胞形态和分布，对照组 UCMSCs 为梭形或不规则多边形，呈鱼群样分布，细胞大小均匀，细胞折光性强，高倍镜下，胞浆内空泡极少或未见空泡；开关培养箱组细胞大小不均，高倍镜下，细胞胞浆内空泡数量增多，随着开关箱次数增多和时间延长，细胞形态越差。（图1）

图1 显微镜下各组UC-MSCs形态比较图（×200倍）

二、细胞数量比较

正常对照组细胞计数为（5.30 ± 0.08）× 106。所有实验组与正常对照组相比较，细胞增殖数量均明显减少。开关箱培养组中，相同开箱次数，随着每次开箱时间的延长细胞增殖速度减慢，不同组细胞增殖数量之间比较差异有统计学意义（F =262.50，F =1434.62，P =0.00，P =0.00）；同样开箱时间条件下，每天开箱10次比5次细胞增殖数减少，具有统计学意义 （t =16.40，t =17.28，t =4.48，P =0.00，P =0.00，P =0.00）；在开箱 10次，每次3 min的细胞图片上明显看到细胞片状死亡脱落（倒置显微镜下×100倍）。（表1，图2，3）

图2 各组脐带间充质干细胞数量比较

表1 开箱时间和次数对细胞增殖的影响（106，±s）

表1 开箱时间和次数对细胞增殖的影响（106，±s）

注：5次，10次的对照组均为正常培养脐带间充质干细胞

次数 对照 1 min 2 min 3 min F 值 P 值5 次 5.3 ± 0.08 4.50 ± 0.14 3.9 0± 0.08 3.27 ± 0.19 262.50 0.00 10 次 5.3 ± 0.08 3.48 ± 0.06 3.15 ± 0.07 2.90 ± 0.07 1434.61 0.00 t 值 16.40 17.28 4.48 P 值 0.00 0.00 0.00

图3 显微镜下各组UC-MSCs 数量比较图(×40 倍)

讨 论

MSCs 除具有参与构成造血微环境外，还具有多向分化潜能[2]，可分化为骨、脂肪、软骨和肌肉等，参与机体的生长与损伤的修复过程[3]。研究人员不仅在骨髓中分离培养出骨髓MSCs，近年来从脐带中也分离培养出 MSCs[4]。UC-MSCs 以取材方便、无创伤、没有伦理问题且生长曲线短等优点成为研究的热点[5]。UC-MSCs具有MSCs的表面标志，CD10、CD13、CD29、CD44、CD90、CD166、CD106、SH2(CD105)和HLA-l阳性，CD14、CD33、CD56、CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR 阴性[5]。SH2、CD106和HLA-l表达低于骨髓源性MSCs，第8代UC-MSCs只有少数表达SH2和CD49。MSCs的CFU-F频率、增殖能力和神经细胞诱导分化能力均高于骨髓MSCs，使它成为更理想的细胞治疗的种子细胞[7]。如何短时间内获取大量功能状态良好的MSCs并维持其原始状态以及控制MSCs分化方向是当前研究的热点。在UCMSCs培养过程中，本研究发现细胞的增殖速度和形态差异性很大，同等复苏或传代条件下的细胞达到80﹪融合的时间存在差异。影响MSCs生长、功能状态及分化的因素很多，包括分离方法[8]、CO2浓度、pH值、温度、生长因子、血清、培养基、剪切力和细胞密度等。本研究排除了试剂、细胞种植密度和操作等因素，考虑在细胞培养中可能引起细胞数量和质量差异的是开关培养箱引起温度和CO2的降低。CO2分压能够维持培养液的pH值在一定的范围，zhao等[9]研究表明，体外细胞培养中，细胞可耐受pH值6.0～8.0，但当CO2分压降低，培养液pH值> 7.6后细胞生长状态明显受影响。

本研究在细胞培养过程中，要定期检测培养箱的温度和CO2浓度，应尽量控制培养箱的温度和CO2浓度的稳定，避免频繁开关培养箱引起温度和CO2浓度的降低，导致细胞增殖减慢和细胞分化。控制细胞培养中培养箱温度和CO2浓度的稳定能缩短培养时间，提高细胞质量，减少培养成本，保证细胞稳定生长，让 UC-MSCs更好地应用于临床研究。

1 殷晓雪, 陈仲强, 郭昭庆, 等. 人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定[J]. 中国修复重建外科杂志, 2004, 18(2):88-91.

2 Thomas HK, Yuan XF, Ardeshir B. Adult stem cells in tissue engineering[J].Expert Rev Med Devic, 2009,6(6):621-640.

3 Jang YK, Jung DH, Jung MH, et al. Mesenchymal stem cells feeder layer from human umbilical cord blood for ex vivo expanded growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells[J]. Annals of Hematology, 2006,85(4):212-225.

4 Kestendjieva S, Kyurkchiev D, Tsvetkova G, et al.Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord[J]. Cell Biol lnt, 2008,32(7):724-732.

5 Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review：human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells[J]. Stem Cells, 2007, 25(11):2886-2895.

6 袁源, 杨树源, 韩忠朝, 等. 人脐带间充质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究[J]. 中华实验外科杂志,2006, 23(1):118.

7 马廉. 人脐带间充质干细胞的生物学特性及神经分化研究[D]. 广东:汕头大学, 2005.

8 徐燕, 李长虹, 孟恒星, 等. 人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(32):6289-6294.

9 Zhao F, Pathi P, Grayson W, et al. Effects of oxygen transport on 3-D human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model[J]. Biotechnol Prog, 2005,21(4):1269-1280.