乳酸菌S-层蛋白及其黏附性相关研究技术

范郁冰，肖 荣，李宗军*

(国家植物功能成分利用工程技术研究中心功能食品分中心，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

乳酸菌S-层蛋白及其黏附性相关研究技术

范郁冰，肖 荣，李宗军*

(国家植物功能成分利用工程技术研究中心功能食品分中心，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

乳酸菌为人体的重要生理性细菌，在维持人体肠道生态环境、提高机体免疫力等方面起到重要的作用。然而，乳酸菌发挥这些生理功能的重要前提是黏附到肠细胞的表面。随着研究的深入，越来越多的研究表明乳酸菌S-层蛋白对宿主细胞具有黏附性，如罗伊氏乳酸菌S-层蛋白可与黏蛋白及人结肠癌细胞HT-29进行黏附。在研究乳酸菌S-层蛋白对宿主细胞的黏附时，人们采用了不同的方法。一些常用的基本方法有SDS-PAGE、层析纯化技术、显微镜观察技术等。随着新技术的应用，表面等离子共振技术、免疫学技术等也用于研究S-层蛋白的黏附性。本文将着重介绍S-层蛋白及S-层蛋白黏附性研究的相关技术。

乳酸菌；S-层蛋白；黏附性；提取；纯化

乳酸杆菌是人及动物肠道内最重要的生理性细菌之一[1]，它不仅对人体肠道有益生的作用，同时也可以预防和治疗肠道疾病[2]。进入肠道的乳酸菌通过黏附定殖于肠黏膜表面以保护肠黏膜细胞免受各种病原微生物的损伤，所以乳酸菌在肠道内的黏附、定殖是其发挥生理作用的前提和基础。乳酸杆菌和宿主肠上皮细胞的黏附与乳酸菌体表面成分作用有关，如脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)、细胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)和细胞表面蛋白(surface layer protein，SLP)等，其中细胞表面蛋白起着重要的作用[3]。

研究乳酸菌表层蛋白的黏附性对于了解乳酸菌黏附肠细胞的机制有着关键的作用，本文对已应用到乳酸菌表层蛋白黏附性研究的各种技术进行阐述，以便为以后的研究提供更好的基础。

1 乳酸菌S-层蛋白

1.1 乳酸菌S-层蛋白的特点

细菌表面性质和结构在细菌对宿主的黏附中起着重要的作用[4]。过去30多年的研究发现，在古生菌和细菌中最常见的一种表面结构是由单分子蛋白质亚单位组成的晶状体结构，称为S-层蛋白(图1)[5]。在多数细菌中，S-层蛋白与胞外基质(例如纤维蛋白、纤层蛋白或其他的胶原蛋白)均具有黏附作用[6]。S-层蛋白晶体有斜形、正方形和六边形。根据不同的晶格类型，S-层蛋白可由1、2、4、5或6个蛋白质亚基组成[7]。每个亚基中心距离为2.5～35nm。相对于表面而言，S-层蛋白的里面粗糙一些。S-层蛋白为网孔状结构，其覆盖面积可达总面积的70%。

在嗜酸乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌及短乳杆菌中均发现S-层蛋白[8]。这些种属中的S-层蛋白具有相同的特性，分子质量在25～71kD之间[9]，等电点在9.35～10.04之间。尽管在许多革兰氏阳性细菌中发现了S-层蛋白的糖基化结构[10]，但是在大多数乳酸菌中S-层蛋白是非糖基化的，目前仅在布氏乳杆菌中发现有糖基化结构[11]。许多乳酸菌含有1～2个编码S-层蛋白的基因。由S-层蛋白的氨基酸分析可知，S-层蛋白含有较高的疏水性和酸性氨基酸。其中以赖氨酸为主，含有少量的精氨酸、蛋氨酸和组氨酸，在极少的S-层蛋白中发现含有半胱氨酸。到目前为止，所有已鉴定的乳酸杆菌表层蛋白都具有由 25～30 个氨基酸构成的信号肽，这些信号肽的长度可以通过 von Heijne[12]所提供的方法进行预测。

图1 电镜下细菌表面S-层蛋白冰冻刻蚀照片[9]Fig.1 Electronic micrograph of bacterial surface S-layer proteins[9]

S-层蛋白具有一系列的功能，其基本功能有：维持细胞形态结构稳定；力的稳定性；热稳定性；渗透压稳定性。亚功能：包裹细胞；提供周质空间；形成网孔状结构与膜外蛋白相连；保护细胞免受外界环境因子的影响；防止微粒的进入；免疫功能；与外环境相互作用；离子交换、连接金属及生物矿物质；表面黏附；毒力因子；噬菌体受体。尽管对于S-层蛋白的结构、化学组成、组装以及基因等方面已经具有一定的了解，但是在对于S-层蛋白的特殊功能上的认识还不是很透彻。

1.2 乳酸菌S-层蛋白的黏附性

虽然对乳酸菌S-层蛋白的功能还不是很了解，但是随着研究的深入，越来越多的研究表明乳酸菌S-层蛋白对宿主细胞具有黏附性。一些乳酸菌的S-层蛋白已经被发现具有黏附性，如罗伊氏乳酸菌S-层蛋白可与黏蛋白及人结肠癌细胞HT-29进行黏附，短乳杆菌ATCC 8287 S-层蛋白与细胞外基质纤维连接蛋白具有较高的黏附性[13]，而瑞士乳杆菌的S-层蛋白与肠细胞的黏附可以有效抑制大肠杆菌对肠细胞的黏附。

2 黏附性相关研究技术

人们采用了不同的研究方法对乳酸菌S-层蛋白的黏附性进行研究，如免疫印记法、表面等离子共振法、荧光法等。下面将介绍几种在研究S-层蛋白的黏附性时所用到的技术方法。

2.1 S-层蛋白提取分离纯化技术

2.1.1 S-层蛋白的提取技术

人们对S层蛋白的提取最早是在1979年，Masuda等[15]用高浓度的尿素将S-层蛋白从短乳杆菌中提取出来。在1980年，Masuda等[16]又采用了高浓度的盐酸胍提取短乳杆菌S-层蛋白。在2004年，Garrote等[17]利用高浓度的氯化锂来提取开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)中的S-层蛋白。

大多数S-层蛋白可以通过利用高浓度的溶剂来破坏其氢键已达到分离的目的[6]。常用的溶剂有盐酸胍和氯化锂。一般的分离步骤为：将乳酸菌于MRS液体培养基中培养，离心收集菌体；PBS冲洗2～3次，加入高浓度提取剂，静置反应一段时间；高转速离心收集上清液；低温透析过夜便可得到粗的S-层蛋白提取物。对于提取不同菌株中的S-层蛋白，可以采用不同的溶剂处理以达到更好的效果。

2.1.2 S-层蛋白的SDS-PAGE电泳分离技术

由于采用LiCl或盐酸胍等溶剂从细菌表面提取出的S-层蛋白中会含有许多杂质蛋白，因此，还需要采用进一步的方法对其进行纯化。常用的方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

将初步分离得到的S-层蛋白悬浮于缓冲液中，煮沸5～10min后加入染色剂即可用于进行SDS-PAGE。在进行S-层蛋白的纯化时，常用的凝胶的浓度为10%左右。图2为利用SDS-PAGE分离纯化得到的S-层蛋白，其分子质量为46kD[18]。

图2 SDS-PAGE分离得到的S-层蛋白条带[18]Fig.2 SDS-PAGE analysis of selected S-layer proteins[18]

2.1.3 S-层蛋白的纯化技术

对S-层蛋白进行研究时，可能需要进一步的获得纯的S-层蛋白，常采用的方法是层析纯化的方法。层析纯化包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、聚焦层析等。

1993年，Boot等[19]采用了阳离子交换层析纯化S-层蛋白。实验将S-层蛋白粗提取物通过阳离子交换层析柱，用不同梯度浓度的缓冲液的冲洗，从而将S-层蛋白与杂质蛋白分离，得到纯度较高的S-层蛋白。除此之外，还可以利用S-层蛋白的其他性质来选择不同的层析方法，如已知S-层蛋白的分子质量为40kD左右，则可以采用分辨率在其之间的凝胶来进行纯化。

目前，随着科学技术的进步，对蛋白质的纯化还可以采用高效液相层析。与传统的层析方法向比，高效液相层析具有以下几个优点：介质颗粒的变小，具有更高的分辨率；流速的提高使HPLC提供更快的分离速度；易于实现自动化。

2.2 黏附性显微镜观察研究技术

2.2.1 原子力显微镜观察技术

2005年，Andrea Azcarate-peril等[20]利用原子力显微镜对S-层蛋白进行了研究。原子力显微镜是一种利用原子、分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。与普通的显微镜相比，原子力显微镜具有一定的优点：可以构建三维立体的结构，可以以力的形式直接观察S-层蛋白与基质间黏附力的大小[21]，样品的前处理简单等。

2.2.2 荧光显微镜观察技术

近几年，荧光标记的方法在研究乳酸菌及其S-层蛋白的黏附性中有了一定的应用。有的采用异硫氰酸荧光素标记乳酸菌S-层蛋白[18]，在荧光显微镜下检测其对肠细胞的黏附情况；也有的采用细胞荧光素标记细胞，然后观测乳酸菌对其黏附的情况。

2007年，Kathene等[22]运用荧光标记的方法检测到瑞士乳杆菌的S-层蛋白可以降低大肠杆菌对肠细胞的黏附，从而表明瑞士乳杆菌的S-层蛋白可以与肠细胞黏附。如图3所示，在添加了S-层蛋白之后，大肠杆菌与肠细胞的黏附降低了。

图3 荧光显微镜观察S-层蛋白的黏附性[22]Fig.3 Adhesion of S-layer protein under fluorescence microscope[22]

2.3 基于免疫学的黏附性研究技术

在测定S-层蛋白黏附性实验中，运用的最多的免疫学技术为Western Blot杂交技术。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳将分离的蛋白质样品转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上以作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性蛋白成分。

2005年，王斌等[23]就采用了Western Blot技术研究罗伊氏乳杆菌S-层蛋白对黏蛋白和人结肠癌细胞株HT-29的黏附性。在2008年，刘琼等[24]利用Western Blot杂交技术对S-层蛋白表面展示载体进行检测。

采用Western Blot技术时，是以S-层蛋白为抗原，以制备的标记了的黏蛋白和细胞为抗体，以DAB为显色剂。Western Blot杂交技术主要步骤为将蛋白SDS-PAGE后电转移至PVDF膜上，分别用已标记的黏蛋白和HT-9细胞进行杂交反应，冲洗去除未杂交的黏蛋白或HT-9细胞，DAB显色即可观察到S-层蛋白是否发生了黏附反应。实验结果表明，在罗伊氏乳酸菌中，分子质量为29kD和14kD的S-层蛋白与黏蛋白和HT-9细胞均有黏附性。

2.4 用于黏附性的表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)研究技术

表面等离子共振(SPR)近年来迅速发展为用于分析生物分子相互作用的一项技术[25]，其利用生物大分子间(抗体与抗原、酶与底物等)的特异性结合进行分子识别，并通过光激励→分子识别→光输出→电输出的途径，完成分子相互作用的信息传递与检测[26]。

de Leeuw等[27]利用了SPR技术对S-层蛋白与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)黏附性进行了研究。实验将经过LiCl提取透析后的纯S-层蛋白于20000×g离心20min后，利用羟基琥铂酰二胺将其共价偶联到葡聚糖羧化物上，使S-层蛋白固定至载体表面。而未连接的非共价羟基琥铂酰二胺酯则利用乙醇胺填满。利用表面活性剂(10mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、3mmol/L EDTA、0.5g/mL表面活性剂P20，pH7.4)于25℃活化。将待测的ECM物质(纤连蛋白、层黏连蛋白和胶原蛋白)注入至SPR中，控制流速20μL/min，BlAevaluation 4.1软件分析。S-层蛋白与不同的ECM的黏附如表1所示。实验表明，S-层蛋白与黏蛋白和层黏连蛋白具有较高的黏附性，而与胶原蛋白和纤维蛋白的黏附性很低。

运用SPR技术，可以直接的观测到S-层蛋白与胞外基质黏附性的情况，且采用这种技术，对样品的需求量小，样品无需标记、特异性强、灵敏度高[25]。但是，目前这种方法运用的并不是很普遍，因此，运用此方法可对人们研究S-层蛋白提供新的途径。

表1 S-层蛋白与胞外基质黏附情况Table 1 Binding characteristics of S-layer proteins to extracellular matrix

3 结 语

乳酸菌作为肠道的生理性细菌，在定殖、黏附于肠道上后对维持肠道的稳定性具有重要的作用[28]。S-层蛋白作为乳酸菌的黏附因子之一，已经越来越受到人们的关注。虽然目前对于乳酸菌S-层蛋白黏附性的研究还处于初步阶段，但是随着新的方法的不断引入，人们对S-层蛋白及其黏附性也有了一定的认知。通过本文的阐述，人们已经确定了S-层蛋白的黏附性并获知了其可以与肠细胞黏蛋白、层黏连蛋白发生较好的黏附。然而，S-层蛋白的黏附机理仍未揭开。想要了解这一黏附机理，还需从不同的角度运用各种方法来进行进一步的研究。本实验室也将从分子学、蛋白质组学的角度对乳酸菌S-层蛋白的黏附性进行更加深入的研究。

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LactobacillusSurface Layer Proteins and Research Techniques for Their Adhesion: A Review

FAN Yu-bing，XIAO Rong，LI Zong-jun*
(Functional Foods Branch, National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

Lactobacillus, an important kind of physiological bacteria in the human body, plays an important role in maintaining human intestinal ecosystem environment and intestinal health. However, the most important premise forLactobacillusto execute its physiological functions is the adhesion on the surface of intestinal cells. More and more studies have showed that S-layer protein has the ability to adhere to intestinal cells. For example,Lactobacillus reuterican adhere to mucoprotein and HT-9 cells.Various methods such as SDS-PAGE, chromatographic purification, and microscopic observation have been successfully applied to study the adhesion ofLactobacillusto intestinal cells. The applications of surface plasma resonance and immunological techniques to study S-layer protein adhesion have gained extensive attention as a result of the development of new techniques.In this paper, recent research advances inLactobacillusS-layer proteins and their adhesion are reviewed.

Lactobacillus；S-layer protein；adhesion；extraction；purification

TS201.21

A

1002-6630(2012)01-0294-04

2011-01-22

国家“863”计划项目(2007AA10Z347)

范郁冰(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。E-mail：fan_yubing@163.com

*通信作者：李宗军(1968—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn