基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对干酪乳杆菌体内外黏附性的影响

王莺莺　王慧敏　李小函　王念念　王珺垚　许慧卿

摘要 [目的]研究基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对干酪乳杆菌体内外 黏附性的影响。[方法]利用荧光标记技术对干酪乳杆菌亲本株（L.c）及prtP基因缺失突变株（L.cΔprtP）进行标记，对6～8周龄的BALB/c小鼠进行干预，测定亲本株和突变株体内黏附菌体数量的差异，同时测定其在体外对小鼠肠黏液的黏附性。[结果]L.cΔprtP的黏附率总体上较L.c低，黏附能力较L.c弱。说明干酪乳杆菌的黏附性受lactocepin的影响很大。[结论]干酪乳杆菌体内外黏附性与基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin有关。

关键词 基因prtP；lactocepin；干酪乳杆菌；黏附性

中图分类号 TS201.3 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）18-0130-04

Effect of Membrane Serine Protease Lactocepin Encoding Gene prtP on Adhesion in vivo and in vitro of Lactobacillus casei

WANG Yingying， WANG Huimin， LI Xiaohan et al （School of Tourism and Culinary·Food Science and Engineering， Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225127）

Abstract [Objective] To study the effect of membrane serine protease lactocepin encoding gene prtP on adhesion in vivo and in vitro of Lactobacillus casei.[Method] L. casei parent strains （L.c） and the prtP gene mutant strains （L.cΔprtP） were marked by fluorescence， we experimented with BALB/c mice of 6 to 8 weeks which were used to measure the number of bacteria in each part of the intestinal tract and compare them while analyzed the adhesion of lactobacillus to mice intestinal mucus in vitro. [Result]The adhesion rate of L.c Δ prtP was generally lower than L.c， and the ability of colonize was weaker than L.c. Therefore， lactocepin played an important role in the adhesion of L. casei. [Conclusion]Adhesion in vivo and in vitro of mice by L. casei is related to serine protease encoding gene prtP.

Key words Gene prtP；Lactocepin；Lactobacillus casei；Adhesion

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）是常见于人体胃肠道以及传统的发酵乳制品中的乳杆菌属的一种酪乳杆菌群。有报道称该菌种可以抵御胃液、胆汁等的侵蚀，在肠道中大量存活。大量的文献显示，干酪乳杆菌的应用范围很广，具有很高的研究价值[1]。

干酪乳杆菌被广泛研究应用是由于其良好的益生性，能够增强胃肠道消化系统的生物性功能，有效抑制有害菌在肠内的繁殖，从而改善肠道机能，其益生功能在很大程度上取决于该菌在胃肠道的黏附特性，其黏附机制是乳酸菌类细胞表面的磷脂壁酸、多糖、完整肽聚糖以及表层蛋白等物质对肠道进行作用[2]。因此，关于乳酸菌黏附性的研究十分重要，但是国内目前关于干酪乳杆菌的研究和应用尚处于起步阶段，缺乏分子层面的研究。干酪乳杆菌亲本株及突变株的功能、作用机理以及应用相关的课题研究领域具有非常广泛的发展空间[3]。

该研究从基因层面深入研究干酪乳杆菌生物学特性，为干酪乳杆菌L.c亲本株及其lactocepin缺失的突变株L.c△prtP创造了体内和体外2种环境，体内实验的对象是BALB/c小鼠（6～8周龄），通过进行动物实验利用荧光标记法观察亲本株和突变株在体内的黏附率变化，体外模型采用的是小鼠原代的小肠黏液，并通过建立标准曲线来计算乳酸菌黏附率，目的是通过比较亲本株与突变株在体内外的黏附率，明确干酪乳杆菌体内外黏附性受lactocepin的影响，进一步阐明其对肠道的益生作用，从而为实际应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。干酪乳杆菌Lactobacillus casei（L.c），干酪乳杆菌prtP敲除突变株（L.c△prtP）由扬州大学旅游烹饪·食品科学与工程学院实验室保存。

1.1.2 培养基及主要试剂。MRS肉汤培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；cFDA-SE（碧云天生物技术研究所）；结晶紫（天津市致远化学试剂有限公司）；甲醛[中国恒利试剂厂（上海）]；柠檬酸（天津市北辰方正试剂厂）；十二水磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）；二水磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.1.3 实验动物。6～8周龄的BALB/c小鼠，45只，购于扬州大学动物医学中心。

1.2 方法

1.2.1 体内黏附实验。

1.2.1.1 L.c及L.c△prtP的荧光标记。将5.0 mg cFDA-SE溶解在8.969 mL的DMSO试剂中，用0.22 μm膜过滤除菌，在-20 ℃条件下储存备用。在MRS肉汤培养基中接入L.c及L.c△prtP，接种量为1%（V/V），在培养箱内37 ℃、5%CO2培育18 h，3 000 r/min下离心5 min，弃去上清，收集菌体沉淀。用无菌PBS漂洗沉淀3次后，重悬于PBS中，并调节浓度至1×109 CFU/mL。向乳酸菌悬液中加入1 mmol/L的cFSA-SE贮存液，至浓度为20 μmol/L，避光37 ℃静置20 min，4 ℃、5 000 r/min条件下离心10 min，用PBS洗涤3次，以去除多余的荧光染料。将菌体重悬于PBS溶液中，加入0.75%甲醛固定液，用流式细胞仪在488 nm的激发波长下检测cFSA-SE标记率。

1.2.1.2 动物实验。将6～8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组，每组15只。第1组作为对照组，用200 μL活的未标记的乳酸菌（1×108 CFU/mL）灌胃；第2组用200 μL cFDA-SE标记的活的L.c（1×108 CFU/mL）灌胃；第3组用200 μL cFDA-SE标记的活的L.c△prtP（1×108 CFU/mL）灌胃。灌胃后3组小鼠均正常饮水喂食，在灌胃后的第1、2、4、6和7天脱颈处死小鼠，在无菌环境下取小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠各2 cm，纵向剪开，清除肠道附着物，用500 μL无菌PBS溶液反复冲洗，用400目铜网过滤，然后用甲醛固定液（0.75%）固定，避光保存，用流式细胞仪于488 nm激发波长下进行检测，分析确定L.c及L.c△prtP在小鼠肠道各部位的黏附情况，按如下公式计算黏附率（公式中的2 cm表示肠段长度）：

黏附率（CFU/cm）= 阳性乳杆菌总数 2 cm

1.2.2 体外肠黏液黏附实验。

1.2.2.1 肠黏液制备。参考文献[4]脱颈处死6～8周龄的BALB/c小鼠，解剖取出小肠放在冰面上，用pH 7.2、0.01 mol/L无菌PBS反复冲洗3～5次，纵向剪开肠壁，用无菌载玻片刮取小肠内表皮黏液，与2倍体积pH 7.2、0.01 mol/L的PBS混匀，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，用考马斯亮蓝法测定黏液蛋白的浓度，分装后在-20 ℃条件下保存备用。该试验参照Vesterlund等[5]建立的方法，稍作修改。

1.2.2.2 菌株的黏附。取96孔板加入小鼠小肠黏液提取液（2.0 mg/mL），每孔100 μL，4 ℃条件下过夜固定，去除未固定的提取液。 L.c和L.c△prtP悬液（pH4.0）各加4个平行孔，每孔100 μL，4 ℃培育2 h，用250 μL PBS（pH4.0）反复洗涤3～4次，以去除未黏附的乳酸菌。将96孔板置于烘箱60 ℃、30 min，每孔各加100 μL 0.1%结晶紫染色，50 min后用250 μL PBS（pH4.0）洗涤5次，然后加入100 μL 0.02 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 4.3）重悬，室温下放置60 min，测定600 nm处的吸光值（OD600）。

1.2.2.3 建立标准曲线。取10 mL不同浓度的乳酸菌PBS菌悬液于10 mL离心管中，每个浓度取3组平行，8 000 r/min离心10 min，弃上清，用1 mL 0.1%结晶紫染色50 min，收集菌体，PBS（pH4.0）洗涤5次，加入1 mL 0.02 mol/L檸檬酸盐缓冲液（pH4.3）重悬，室温放置60 min，并测定600 nm处的吸光值，确定OD600和乳酸菌细胞数的关系，建立曲线。

1.2.2.4 数据计算。计算96孔板上黏附的乳酸菌数量，用黏附的乳酸菌数和加入的乳酸菌的比值来代表菌株的黏附能力。

1.2.3 数据处理。数据均以平均值±标准差表示，使用SPSS16.0软件进行分析。P<0.05即结果具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 L.c及L.c△prtP在小鼠肠道各部位的黏附情况

2.1.1 L.c 和L.c△prtP在小鼠不同肠段中的黏附情况。用cFDA-SE标记的L.c 和 L.c△prtP灌胃小鼠，分别在灌胃后的第1、2、4、6和7天处死，用流式细胞仪检测小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠中L.c 和 L.c△prtP的黏附情况。

2.1.2 流式细胞仪检测小鼠不同肠段中L.c和L.c△prtP的黏附情况。

从图2可以直观地看出L.c在各肠段的黏附率普遍高于L.c△prtP，与该研究提出的假设一致。

2.2 L.c及L.c△prtP对小鼠肠黏液的黏附

2.2.1 标准曲线。根据相关参考文献[6]，使用浓度为2.0 mg/mL的黏液蛋白，pH为4的磷酸缓冲液。若浓度低于2.0 mg/mL，则蛋白无法铺满细胞板，乳酸菌不能进行有效黏附；若浓度高于2.0 mg/mL，则蛋白过多堆叠，乳酸菌无法与下层蛋白进行有效黏附，在洗涤时随表层蛋白一同被去除。缓冲液pH过大或过小都会造成黏附量降低，pH为4时两株菌黏附量都相对较大。

研究确定了OD600和乳酸菌细胞数的关系，并建立了曲线，当细菌浓度为1×108～1×109 CFU/mL时，L.c细菌浓度（x）与测得OD600（y）的线性关系为y=0.099 8x-0.086 8，R2=0.996 4（图3A）；当细菌浓度为1×108～1×109 CFU/mL时，L.c△prtP细菌浓度（x）与测得OD600（y）的线性关系为y=0.112 3x-0.064 8，R2=0.993 1（图3B）。通过该方程计算96孔板上黏附的乳酸菌数量，用黏附的乳酸菌数和加入的乳酸菌数的比值来体现菌株的黏附能力。

2.2.2 乳酸菌对小鼠小肠黏液的黏附。

通过建立的线性关系计算得出干酪乳杆菌L.c和L.c△prtP对小鼠肠黏液的体外黏附能力。L.c的黏附率为4.638%，L.c△prtP的黏附率为3.665%，黏附能力存在显著差异，L.c黏附能力高于L.c△prtP（P<0.05）。

3 讨论

对于干酪乳杆菌的研究包括体内和体外两个方面，对小鼠小肠黏液建立测定干酪乳杆菌L.c亲本株以及乳杆菌的lactocepin缺失突变株L.c△prtP黏附能力的体外模型，同时采用荧光标记法观察两株菌在小鼠体内的黏附情况，得出亲本株与突变株在体内外黏附性的差异，明确lactocepin是否缺失对干酪乳杆菌体内外黏附性的影响[6]。

试验结果得到在体外L.c小鼠肠黏液的黏附率为4.638%，L.c△prtP小鼠肠黏液的黏附率为3.665%，L.c△prtP的黏附性明显低于L.c，这表明干酪乳杆菌小鼠肠黏液黏附性受基因prtP编码的丝氨酸蛋白酶lactocepin的影响较大。在体内黏附实验中，干酪乳杆菌及其突变株在小鼠的十二指肠、空肠、回肠、结肠中的黏附量呈现较大的差异。除小鼠结肠外，在小鼠的空肠、回肠以及十二指肠中，L.c的黏附量整体高于L.c△prtP。但是在空肠和十二指肠中，L.c的黏附量随着时间的增长均有不同程度的下降，且发现回肠中总黏附菌量相较于小肠其他部位要高很多，这说明干酪乳杆菌在肠道内主要黏附部位是回肠。由于干酪乳杆菌在体内的黏附受到多重因素的影响，对于同一菌株而言不同的黏附对象还会表现出宿主的特异性，暂时无法得知干酪乳杆菌在小鼠肠道不同部位黏附率产生差异的原因。但可得出的结论是乳酸菌对肠黏液以及小鼠肠道细胞的黏附是受prtP基因编码的细胞外膜丝氨酸蛋白酶lactocepin的影响介导的，但具体的黏附机制以及是否会受到其他因素作用需进一步研究。

干酪乳杆菌可以在肠道内大量存活， 起到调节肠内菌群平衡、改善人体肠道的消化吸收功能、缓解乳糖不耐症以及过敏等益生保健作用[7-8]，因此要积极利用现有的科学资源充分发挥出益生菌对于机体的保健功能，研发出安全有效的益生菌微生态制剂或其菌体相关产物的免疫调节剂，为促进生命科学的发展做贡献。

参考文献

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[4] 李娟，张耀庭，曾伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.

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