乳源酪蛋白糖巨肽抗细胞凋亡干预小鼠溃疡性结肠炎效应研究

王 华，陈庆森*

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

乳源酪蛋白糖巨肽抗细胞凋亡干预小鼠溃疡性结肠炎效应研究

王 华，陈庆森*

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

研究乳源酪蛋白糖巨肽(CGMP)对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜细胞凋亡的影响。利用恶唑酮诱导小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型，采用低、中、高剂量的CGMP组(剂量分别为5、50、500mg/(kg·d))和药物柳氮磺胺吡啶(剂量为40mg/(kg·d))连续灌胃4d，正常对照组和模型对照组每天灌胃相应剂量的超纯水；用HE染色和TUNEL法检测小鼠结肠大体形态损伤和病理组织学及其细胞凋亡变化。结果表明：低、中、高剂量CGMP组均可在一定程度上改善恶唑酮诱导的结肠炎中结肠病理损伤和细胞凋亡表现，尤其以中剂量CGMP组的作用较为明显，与药物治疗组相比不存在显著性差异。因而，证实CGMP作为一种生物活性物质可以通过抗结肠组织细胞凋亡具有抑制溃疡性结肠炎的功能。

酪蛋白糖巨肽；细胞凋亡；小鼠；恶唑酮；溃疡性结肠炎

酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)，是乳中κ-酪蛋白(κ-CN，含有169个氨基酸残基，是酪蛋白中唯一含有糖成分的、对钙不敏感的蛋白质)上的一个多肽片段。干酪加工时凝乳酶水解酪蛋白(主要是κ-CN)的苯丙氨酸-蛋氨酸键，生成不溶性的副-κ-CN(肽链的1～105部分)和可溶性的多肽(肽链的106～169部分)两部分，此多肽含有较多的碳水化合物，称之为“糖巨肽”，酪蛋白来源的糖巨肽称为“酪蛋白糖巨肽”。CGMP的研究始于1965年Delfour等[1]发现的一种含有唾液酸的糖肽，之后人们对其进行了大量的研究，到目前为止已经发现CGMP有诸多生物学活性，比如抑制细菌、毒素的附着和定殖[2]、免疫调节功能[3]等活性，但目前还未见有对肠道黏膜细胞凋亡的相关报道。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn,s disease，CD)，是一类肠道慢性炎症性疾病, 其病因及发病机制尚未十分明确。目前认为形成IBD的主要原因有3个：1)基因的敏感性，如关键蛋白的突变促进微生物进入肠上皮；2)肠道抗原，如定殖于肠道的微生物或食物抗原；3)环境因素，如压力、吸烟等[4]。随着分子生物学技术、免疫学以及基础研究的不断深入，目前认为肠黏膜细胞凋亡失调在IBD的发病中占有十分重要的地位，肠黏膜上皮细胞凋亡过度、肠黏膜固有层T淋巴细胞和中性粒细胞凋亡迟滞可能是IBD发生及发展的原因之一[5]。而目前常用的3类药物(水杨酸类、类固醇激素和免疫抑制剂)IBD的治疗效果并不理想，并且还存在一定的副作用[6]，因此寻找一种新的治疗物质成为目前该研究的热点。而CGMP作为一种从乳中提炼出来的生物活性物质以其多种生物学活性而成为本研究的首选。本实验采用恶唑酮制造UC小鼠模型，并用不同剂量CGMP进行灌胃，以研究CGMP对UC小鼠结肠细胞凋亡的干预和治疗情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白糖巨肽(CGMP) 新西兰Tatua公司；恶唑酮(OXZ) 美国Sigma公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒 瑞士Roch公司；其他剂均为国产。

1.2 仪器与设备

电热恒温干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；石蜡切片机、生物组织摊片机、生物组织烤片机 金华市益迪医疗设备厂；倒置显微镜 日本Nikon公司。

1.3 实验动物

Balb/c小鼠，SPF级，雄性，体质量(20±2)g，小鼠常规饲料购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及实验设计

Balb/c小鼠72只，适应性喂养一周，随机分为6组，每组12只：正常对照组、模型对照组、低剂量CGMP组(5mg/(kg·d))、中剂量CGMP组(50mg/(kg·d))、高剂量CGMP组(500mg/(kg·d))和药物治疗组(40mg/(kg·d))。

1.4.2 UC模型制作[7]

小鼠腹部剃毛致敏禁食36h后，将硅胶管从肛门插入，正常对照组灌注50%乙醇0.15mL，其余组均灌注1g/100mL OXZ(OXZ溶于50%乙醇)0.15mL，灌肠后对3个CGMP组小鼠灌胃相应剂量的CGMP，药物组灌胃相应剂量的柳氮磺胺吡啶，正常对照组与模型组灌胃相应剂量的超纯水，此记为第1天处理，连续灌胃4d。每天观察小鼠状态(大便性状、精神、活动、饮食量等)，测定所有小鼠的体质量变化及饮食情况，并作详细记录。拉颈处死小鼠，打开腹腔，剪取结肠段，对明显病变处进行大体形态损伤评分标准如表1所示[8]。

表1 小鼠结肠大体形态损伤评分表Table 1 Evaluation criteria for visible lesions in mouse colon

取1cm病变结肠于4%甲醛中固定24h，先经梯度浓度的乙醇脱水处理，二甲苯透明，石蜡包埋后切成5μm切片，贴于防脱载玻片上经展片、烤片，脱蜡复水，苏木精染色，盐酸分化，梯度乙醇脱水，伊红染色后，经中性树胶封片以供病理组织学观察。小鼠结肠组织学评分标准如表2所示。

表2 小鼠结肠病理组织学评分标准[9]Table 2 Scoring scales for histopathological evaluation of mouse colon[9]

1.4.3 病变结肠组织细胞凋亡TUNEL分析

TUNEL检测方法采用Gavrieli等[10]的方法并稍作改动，操作步骤如下：切片经脱蜡复水后，用蛋白酶K(20μg/mL)在室温条件下作用15min，PBS冲洗3次每次5min，3%的H2O2室温孵育10min，PBS冲洗3次每次5min，用正常山羊血清、3g/100mL牛血清白蛋白室温封闭30min，玻片甩干后滴加TUNEL反应混合液50μL于37℃暗室中孵育60min，PBS冲洗3次每次5min，用正常山羊血清、3g/100mL牛血清白蛋白室温封闭30min，载玻片用力甩净后滴加Converter-POD液50μL于37℃孵育30min，PBS冲洗3次每次5min，滴加DAB显色液室温下显色30～90s，流水冲洗终止反应，苏木精复染、盐酸分化脱水、中性树胶封片光学显微镜下观察细胞凋亡情况。其中阴性对照为TUNEL反应混合液中不加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)孵育，其余步骤相同。

结果判断：凋亡的结肠上皮细胞核呈棕褐色或棕黄色并定位于细胞核，对照HE切片并根据以下标准判断着色细胞为凋亡细胞：1)单个散在分布；2)核固缩或染色质浓聚附边或核碎裂；3)周围无炎症反应[11]。细胞凋亡的统计方法为：每张切片计数5个高倍镜视野(×400)中的凋亡阳性结肠上皮细胞核数，按下式计算结肠上皮细胞凋亡指数，取其平均值。

1.4.4 统计学处理

所有实验数据利用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，以t检验进行方差分析，处理结果用±s表示。

2 结果与分析

2.1 各组小鼠一般状态及体质量的变化

图1 各组小鼠体质量变化Fig.1 Body weight changes of mice in each group

正常对照组小鼠前2d有轻度毛发松散、肛部黏连、食欲减少，而第3天则表现为大便及饮食正常，毛发有光泽。OXZ模型对照组小鼠表现为食量减少，毛发松散、无光泽，呆滞且有不同程度的腹泻，肛部黏连。3个CGMP组小鼠前2d与模型对照组无明显性差异，饮食量从第3天开始与正常对照组基本相同，并且毛发松散、无光泽程度逐步得到缓解。药物治疗组小鼠与CGMP组各剂量组均无明显差异。各组小鼠体质量变化结果见图1。正常对照组小鼠第1天体质量略有下降，从第2天开始体质量增加而OXZ模型对照组小鼠体质量一直处于下降趋势。3个CGMP组小鼠造模后体质量前2d也有所下降，但下降幅度较模型组低，第3天体质量开始回升，但与正常对照组之间还存在一定差异性。药物治疗组小鼠体质量第1天有所下降，从第2天开始有回升趋势，其余与3个CGMP组无明显差异。

2.2 各组小鼠结肠组织形态观察结果

将小鼠造模后第5天拉颈处死解剖取其结肠，观察发现正常对照组小鼠结肠组织正常，无水肿、血点出现；模型对照组能看见明显的水肿、大面积血点。而3个CGMP组和药物治疗组与模型对照组相比，水肿减轻，有散落的小血点，各组小鼠结肠组织形态经放大40倍后的观察结果见图2。各组小鼠结肠组织形态经放大400倍后的观察结果见图3。

图2 各组小鼠结肠病理组织学变化(×40)Fig.2 Histopathological changes of mouse colon in each group(×40)

图3 各组小鼠结肠病理组织学变化(×400)Fig.3 Histopathological changes of mouse colon in each group(×400)

由图2、3可知，正常对照组结肠组织黏膜上皮完整，固有层腺体排列正常，黏膜及黏膜下层无炎症细胞浸润，未见糜烂及溃疡；而OXZ模型组结肠组织黏膜上皮细胞脱落，固有层腺体排列紊乱，黏膜及黏膜下层有大量炎症细胞浸润，可见多处大面积糜烂和溃疡；3个CGMP组对小鼠结肠黏膜均有一定的修复作用，固有层排列开始恢复正常，膜及黏膜下层炎症细胞浸润减少，可见小面积糜烂和溃疡，其中中剂量CGMP组作用效果最为明显；药物治疗组对小鼠结肠中固有层排列基本恢复正常，黏膜及黏膜下层基本无炎症细胞浸润，无糜烂和溃疡，其修复作用是最为明显的，但与正常对照组相比还存在一定差距。

表3 各组小鼠结肠大体形态指数及组织学评分(±s)Table 3 Visible lesion index and histological score of mouse colon in each group (±s)

表3 各组小鼠结肠大体形态指数及组织学评分(±s)Table 3 Visible lesion index and histological score of mouse colon in each group (±s)

注：*.与正常对照组相比，差异显著(P＜0.05)；+.与OXZ模型对照组相比，差异显著(P＜0.05)。

组别 大体形态损伤评分 组织学评分正常对照组 0.20±0.00 0.13±0.00 OXZ模型对照组 5.38±0.92* 2.95±0.86*低剂量CGMP组 2.25±1.12*+ 1.90±0.75*+中剂量CGMP组 1.50±0.89*+ 1.36±0.56*+高剂量CGMP组 2.00±0.98*+ 1.75±0.68*+药物治疗组 1.25±1.20*+ 1.05±0.55*+

表4 各组小鼠结肠组织细胞凋亡表现(±s，n=8)Table 4 Colonic apoptosis index of each group (±s，n=8)

表4 各组小鼠结肠组织细胞凋亡表现(±s，n=8)Table 4 Colonic apoptosis index of each group (±s，n=8)

注：**.与正常对照组相比，差异极显著(P＜0.01)；+. 与OXZ模型对照组相比，差异显著(P＜0.05)；++.与OXZ模型对照组相比，差异极显著(P＜0.01)。

组别 正常对照组 OXZ模型对照组 低剂量CGMP组 中剂量CGMP组 高剂量CGMP 组药物治疗组细胞凋亡指数/% 4.04±3.02 77.39±8.34** 66.98±13.10** 32.20±11.62**++ 55.82±9.78**+ 25.37±7.45**++

2.3 各组小鼠结肠大体形态损伤及组织学评分

由表3可见，模型对照组小鼠的结肠大体形态损伤指数和组织学评分比正常对照组显著增高，而低、中、高剂量的CGMP组和药物治疗组与模型对照组相比显著降低了结肠的损伤指数和组织学评分，但与正常对照组相比还存在显著性差异，虽然药物治疗组与低、中、高剂量的CGMP组相比，结肠的损伤指数和组织学评分有所降低，但其与中剂量CGMP组之间无显著性差异。

2.4 小鼠结肠组织细胞凋亡观察结果

图4 各组小鼠结肠黏膜凋亡TUNEL分析(×400)Fig.4 TUNEL analysis of the apoptosis of colonic mucosa in each group (×400)

由图4和表4可知，正常对照组存在生理程序性的细胞凋亡，凋亡比率仅为4.04%，而OXZ模型对照组细胞凋亡比例明显升高，高达(77.39±8.34)%。3个CGMP组与OXZ模型对照组相比均在一定程度上抑制了细胞凋亡，尤其以中剂量组作用明显，与药物治疗组相比无显著性差异。研究发现，无论是药物治疗组还是CGMP组在实验期间都无法使细胞凋亡比例恢复到正常水平，所以增加治疗周期可能对肠黏膜上皮细胞的凋亡恢复是必需的。

3 讨论与结论

UC由于病因不明，治疗棘手，被世界卫生组织列为现代难治病之一。目前，该病在我国的发病率和患病率均有明显的增高趋势。因此，对UC病理机制和治疗方法的研究成为近年来的研究热点。恶唑酮模型以制作简单，重复性好，诱导炎症反应迅速，组织学特征、部位和细胞因子增殖情况均类似于人类UC等[12]而成为当前制造UC模型的首选。本实验用3g/100mL的恶唑酮皮肤致敏后用1g/100mL造模，其实验结果与Heller等[13]研究结果一致，小鼠出现严重腹泻、体质量下降，结肠(特别是在远端结肠)出现明显的糜烂、溃疡、黏膜下层被大量炎症细胞浸润，并且大体形态损伤得分及组织学评分与正常对照组相比均明显升高，说明1%的恶唑酮导致了严重的结肠黏膜损伤和炎症，其造模是成功的。

近年来国内外学者对IBD进行了大量的研究，肠黏膜上皮细胞相互连接是肠黏膜屏障的重要组成部分，它即可以限制抗原(如食物、共生有机体等)渗透到黏膜免疫系统形成口服免疫耐受又可以使宿主对致病菌做出应答[14]。Iwamoto等[15]用TUNEL、免疫组化等多种凋亡检测手段检测到UC和正常结肠凋亡的程度和范围，发现活动性UC病变区域上皮细胞凋亡发生的程度和范围都高于正常组织。Sun等[16]证实细胞凋亡在肠黏膜屏障功能紊乱中起着重要的作用，由此可以推出在IBD中肠黏膜细胞凋亡是屏障被破坏的主要原因之一。Schulzke等[17]研究表明，肠黏膜细胞凋亡导致了离子的流失和水分进入肠腔，引起了腹泻和小分子抗原(分子质量＜4000D)进入肠黏膜，从而产生永久性炎症应答。以上研究结果表明细胞凋亡是IBD形成的主要原因之一，阻止病变结肠细胞过度凋亡可能是IBD治疗的有效方法之一。贾玉臣等[18]研究表明CGMP可保持较完整的上皮细胞，从而有助于维持结肠组织形态的完整。本实验中设计CGMP 3个剂量组(低、中、高)和药物治疗组分别灌胃UC小鼠发现对病变结肠细胞过度凋亡均有一定的干预作用，尤其是中剂量组和药物治疗组相比，对病变结肠细胞凋亡无显著性差异。说明中剂量组的CGMP在UC结肠细胞凋亡中起到了和药物组相似的作用。CGMP作为乳源生物活性多肽，用于UC及相关疾病的治疗对人类不会产生任何副作用。目前国内外对CGMP治疗炎症性肠病的研究还很少，只有Requena等[19]研究表明牛乳来源糖巨肽(bovine glycomacropeptide，BGMP)在治疗由三硝基苯磺酸诱导的CD的回肠炎中起到了与5-氨基水杨酸相似的作用，在葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulphate，DSS)诱导的结肠炎中也起到了明显的抗炎作用[20]。

目前国内外对IBD细胞凋亡机制的研究报道不多，Vetuschi等[21]研究表明在DSS诱导的结肠炎中，结肠细胞凋亡指数明显高于正常对照组，并且细胞凋亡指数与Fas、FasL、p53表达量成正比，由于DSS诱导的IBD模型类似于人类的UC模型，从而可以推出在UC中可能是通过Fas通路和p53通路诱导结肠上皮细胞凋亡的。Strater等[22]研究认为，导致结肠上皮细胞大量凋亡的原因是通过激活Fas/FasL信号转导途径而实现的。A s s i等[23]研究表明在葡聚糖硫酸钠(DDS)诱导的C57BL/6老鼠模型中，用JNK的抑制剂SP600125可以明显的减少结肠上皮细胞的凋亡，说明结肠上皮细胞的凋亡与MAPK家族中的JNK信号通路相关。Requena等[24]研究表明BGMP可以通过磷酸化IκB-α、p50和p65来激活NF-κB信号通路，并认为牛乳来源的酪蛋白糖巨肽(BGMP)可以通过阻止微生物入侵肠道而起到抗炎的作用。而NF-κB是体内普遍存在、能迅速对刺激产生反应的重要核转录因子，参与细胞的凋亡、炎症等生理条件下的基因调控。由此可以推测CGMP阻止结肠细胞凋亡的机制可能是通过NF-κB信号通路，其具体机制还有待于进一步实验验证。

本研究结果表明，CGMP可以通过抑制结肠组织细胞的凋亡明显改善恶唑酮诱导的UC小鼠结肠黏膜的损伤，CGMP作为一种生物活性物质用于治疗UC具有潜在的开发前景。

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Milk-Derived Casein Glycomacropeptide Inhibits Ulcerative Colitis in Mice through Apoptosis Resistance

WANG Hua，CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to explore the effect of casein glycomacropeptide (CGMP) on the apoptosis of colonic mucosal cells in mice with oxazolone-induced ulcerative colitis, the mice were treated respectively with CGMP at the doses of 5, 50 mg/(kg·d)and 500 mg/(kg·d) and sulfasalazine at the dose of 40 mg/(kg·d) by gavage for 4 consecutive days to establish high-, mediumand low-dose CGMP groups and positive control group. The same dose of ultra-pure water was once daily given to the normal control and model control groups. HE staining and TdT2-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay were used to evaluate morphological and histological damage as well as epithelial cell apoptosis in the colon of the mice with oxazoloneinduced ulcerative colitis. The results indicated that CGMP at each doses revealed obvious improvement on oxazolone-induced ulcerative colitis, and the improving effect at the dose of 50 mg/(kg·d) did not significantly differ from that of sulfasalazine.In conclusion, CGMP, a bioactive substance, has promising potential as a nutritional therapy for ulcerative colitis through apoptosis.

casein glycomacropeptide；apoptosis；mice；oxazolone；ulcerative colitis

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0230-05

2011-07-21

国家自然科学基金项目(31071522)

王华(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为生物活性物质的分离筛选。E-mail：wanghuawhwh@126.com

*通信作者：陈庆森(1957—)，男，教授，硕士，研究方向为发酵生物技术、蛋白资源开发与应用。E-mail：chenqs1689@163.com