肾消颗粒质量标准研究*

严 红，张 妍，高丹丹

(天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)

肾消颗粒由黄芪、丹参、淫羊藿、五味子等8味中药组成，用于脾肾两虚型糖尿病肾病及各种肾脏病变引起的蛋白尿，浮肿，腰膝酸痛，尿频或混浊，阳痿遗精，临床效果满意。为有效控制制剂的内在质量，完善并提高原质量标准，本文改进了肾消颗粒中黄芪、淫羊藿的TLC鉴别方法，采用高效液相色谱法测定了淫羊藿中淫羊藿苷和丹参中丹参素钠、原儿茶醛的含量。结果方法准确，重现性好，可用于肾消颗粒的质量控制。制剂质量控制标准的提高，对于保证药物的临床疗效必将产生重要意义。

1 仪器与试药

贝克曼高效液相色谱仪:125高压输液泵，168二极管阵列检测器，Gold Chromatograhy Data System数据工作站。甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂为分析纯;水为纯化水。丹参素钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号110855－200508)，原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检定所，批号110810－200506)，淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号 110737－200413)，黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号11078－1200613)(“2.1”项下使用的对照品)。肾消颗粒(本院制剂室提供，批号 080505、080704、080924)。

2 方法与结果

2.1 黄芪和淫羊藿的TLC鉴别 取本品2 g，研细，加水饱和正丁醇25 ml，超声提取30 min，滤过，滤液用氨试液10 ml提取1次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取缺淫羊藿的阴性对照和缺黄芪的阴性对照样品同法制备阴性对照液。另取黄芪甲苷、淫羊藿苷对照品，分别加甲醇制成每1 ml含黄芪甲苷1 mg、淫羊藿苷0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液、阴性对照液各4 μl、对照品溶液各2 μl，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)5～10℃放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照无此斑点。结果见图1。

图1 黄芪和淫羊藿的TLC鉴别图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Irregular－H C18柱(250 mm ×4.6 mm，10 μm);丹参素钠、原儿茶醛流动相:甲醇－1%醋酸溶液(2∶98);流速:1.0 ml/min，进样量:20 μl;检测波长为280 nm;柱温:29℃;理论板数按丹参素钠峰计算不低于5 000。淫羊藿苷流动相:乙腈－水(30∶70);流速:1.0 ml/min，进样量:20 μl;检测波长为270 nm;理论板数按淫羊藿苷峰计算不低于3 000。

2.2.2 溶液液备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，精密称定，加过膜50%甲醇制成每1 ml含丹参素钠300 μg(相当于丹参素270 μg)、原儿茶醛24 μg的混合对照品储备液。精密吸取丹参素钠、原儿茶醛混合储备液5 ml于50 ml量瓶中，加过膜50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加过膜甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷116 μg的对照品储备液。精密吸取淫羊藿苷储备液2 ml于10 ml量瓶中，加过膜甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品研细过3号筛，取1 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声30 min，取出，放冷，称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得丹参素钠、原儿茶醛供试品溶液。取本品研细过3号筛，取1 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 m l，密塞，称定重量，超声45 min，取出，放冷，称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液20 ml，水浴蒸干，残渣加水4 ml微热溶解，加于预先处理好的D101型大孔吸附树脂柱(柱内径为1.5 cm，柱高10 cm)，吸附 0.5 h，以水、30%乙醇各 50 ml洗脱，弃去，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液60 ml，水浴蒸干，残渣加70%乙醇溶解并转移置10 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，过0.45 μm 滤膜，取续滤液，即得淫羊藿苷供试品溶液。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方取除丹参的各味药材，按制备工艺制成颗粒，按供试品溶液制法制备丹参阴性对照溶液。按处方取除淫羊藿的各味药材，按制备工艺制成颗粒，按供试品溶液制法制备淫羊藿阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液20 μl注入液相色谱仪，结果表明阴性对照溶液无干扰，见图2和图3。

2.2.3 线性关系的考察 精密吸取丹参素钠－原儿茶醛的混合对照品储备液 0.25、1、2、3 和 4 ml，置 10 ml量瓶中，加过膜50%甲醇稀释至刻度;精密吸取上述5种浓度的对照品溶液注入液相色谱仪，按相应色谱条件分析，测定峰面积，以对照品溶液浓度(mg/ml)为纵坐标，峰面积值为横坐标，求得丹参素钠回归方程:Y=8.577 E －008 X(r=0.999 9)。表明在 0.15 ～2.40 μg范围内线性良好。原儿茶醛回归方程:Y=1.288 E －008 X+1.4 E －004(r=0.999 9)。结果表明在0.012 ～0.192 μg范围内线性良好。

精密吸取淫羊藿苷对照品储备液 0.5、1、2、3、4 和5 ml，置10 ml量瓶中，加过膜甲醇稀释至刻度。精密吸取上述6种浓度的对照品溶液注入液相色谱仪，按相应色谱条件分析，测定峰面积，以对照品溶液浓度(mg/ml)为纵坐标，峰面积值为横坐标，淫羊藿苷回归方程:Y=6.307 E －008 X(r=0.999 9)。表明在0.058 ～0.580 μg 范围内线性良好。

图2 对照品(A)供试品(B)阴性对照(C)HPLC色谱图

图3 对照品(A)供试品(B)阴性对照(C)HPLC色谱图

2.2.4 精密度试验 取一份供试品溶液，连续进样6次，测定样品中丹参素钠峰面积RSD为0.86%;原儿茶醛峰面积RSD为1.43%;淫羊藿苷峰面积RSD为1.66%。

2.2.5 重现性试验 取同一批样品研细过3号筛，按“2.2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，进样分析，测得样品中丹参素钠平均含量为1.23 mg/g，RSD 为 1.95%;原儿茶醛平均含量为 0.108 mg/g，RSD 为 2.72%;淫羊藿苷平均含量为 0.358 mg/g，RSD 为 2.08%。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8和24 h测定，测得丹参素钠和原儿茶醛峰面积值的RSD为1.04%和1.70%，测得淫羊藿苷峰面积值的RSD为1.72%，表明肾消颗粒供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 回收率试验 取已知含量的样品(丹参素钠含量为 1.23 mg/g、原儿茶醛含量为 0.108 mg/g)约0.5 g，6份，精密称定，分别精密加入丹参素钠－原儿茶醛混合对照品储备液2 ml，按供试品溶液制备方法操作，进样分析;取已知含量的样品(淫羊藿苷含量为0.358 mg/g)约 0.5 g，6 份，精密称定，分别精密加入淫羊藿苷对照品储备液1.5 ml，按供试品溶液制备方法操作，进样分析。结果丹参素钠、原儿茶醛、淫羊藿苷回收率分别为100.3%、99.0%和96.1%，RSD 分别为 2.23%、2.23%和 1.89%。结果见表 1。

表1 加样回收试验结果

2.2.8 样品测定 取3批样品，按供试品溶液制备操作，按上述色谱条件分别测定样品中丹参素钠、原儿茶醛、淫羊藿苷含量。结果见表2。

表2 含量测定结果(n=2)

3 讨论

本试验以正丁醇直接提取样品制备TLC鉴别用供试品溶液，简化了原标准中甲醇提取，甲醇液蒸干水转溶，正丁醇萃取的操作，TLC斑点清晰，重现性好。本实验在一个展开系统同时鉴别黄芪和淫羊藿，方法简便，专属性强。

曾对丹参流动相及柱温进行考察，结果甲醇－1%醋酸(2∶98)且柱温为29℃时重现性和分离度较好，能同时测定丹参素钠和原儿茶醛。

分别以甲醇、50% 甲醇、稀乙醇、70% 乙醇［1－3］超声提取样品，测定淫羊藿苷含量，结果，70%乙醇提取液淫羊藿苷含量最高。但提取液的杂质峰很高，淫羊藿苷色谱峰相对于杂质峰主峰很小。试验中进一步对提取液分别采用正丁醇萃取法、乙酸乙酯萃取法［4］、D101大孔吸附树脂乙醇梯度洗脱法［5］净化样品，测定淫羊藿苷含量，结果，正丁醇萃取法杂质峰未见明显改善，进一步以氨试液洗除杂质的同时淫羊藿苷损失大;乙酸乙酯萃取法和D101大孔吸附树脂吸附法杂质峰明显降低，淫羊藿苷出峰明显可见，分离好，二者所得淫羊藿苷含量无明显差别。考虑方法的简便、可操作性及试剂的环保，选择柱层析法，方法学验证表明准确可靠，可作为测定本品主药淫羊藿中淫羊藿苷的含量测定方法。

1 安军永，刘敏彦，王玉峰.高效液相色谱法测定仙灵骨葆颗粒中淫羊藿苷的含量.河北中医药学报，2008，23(1):41

2 程朝辉，霍荣昌，李瑾翡.乳增宁片的质量标准研究.中成药，2008，30(4):附11

3 中国药典.一部.2010:839

4 王海涛，张会宗.补肾健骨颗粒质量标准研究.辽宁中医药大学学报，2008，10(4):135

5 付艳丽，徐忠亮，李源君.淫羊藿总黄酮的大孔树脂精制工艺研究.中国医药导刊，2008，10(4):636