RT-HPLC法同时测定血清中利福平和利福喷丁的血药浓度*

柴 健，张 洁，张 立

(天津市海河医院，天津 300350)

利福平(rifampicin，RFP)是肺结核患者首选药物之一，属肝药酶诱导剂，其血药浓度个体差异很大，长期服用可引起t1/2缩短，血药浓度降低［1］，有些患者临床治疗效果不显著。利福喷丁(rifapentine，RFT)是一种新的长效利福霉素类抗生素，与RFP相比，其抗菌谱相似，不良反应更少，但其肝毒性仍较大，尤其在肝脏损伤的结核患者中存在明显的个体差异，为使两药更合理地应用于临床，故对其临床的血药浓度进行监测。在实际工作中，RFP和RFT的治疗药物监测在抗结核药物中占了相当大的比例。由于RFP和RFT属同类药，其结构和理化性质有许多相似之处，固可以考虑在相同的流动相条件下用内标进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC－10A高效液相色谱仪，包括LC－10A泵，SPD－10A紫外－可见检测器(日本岛津);N－2000色谱工作站(浙江大学智能工程研究所);KDC－16H高速离心机。

1.2 试药 RFP对照品(中国生物制品鉴定所，批号130496－200001)、RFT对照品(无锡山禾集团第一制药有限公司提供，批号200507046);对硝基酚(天津市光复精细化工研究所，批号20040706);甲醇(天津市康科德科技有限公司，色谱纯);水为色谱水样(天津市光复精细化工研究所);冰乙酸(天津市运盛化学试剂科技有限公司，分析纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Shim－pack VP－ODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 － 水(70∶30)，用乙酸调pH=7;流速:1 ml/min;检测波长:336 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 标准液的配制 精密称取RFP和RFT对照品各约25 mg，置于25 ml量瓶中，用甲醇溶解，定容，配成浓度为1 mg/ml的标准液。

2.2.2 内标液的制备 精密称取对硝基酚1 mg，加甲醇溶解并稀释至10 ml，充分混匀后再取500 μl，加甲醇定量至50 ml，得1 μg/ml对硝基酚甲醇溶液。

2.2.3 样品溶液的制备 用加液器准确吸取40 μl含药血清(样品取自不同患者)放入带盖塑料小试管内，加入内标液200 μl，混匀，静置5 min后，于高速离心机10 000 r/min离心5 min，取上清液于450 μm滤头过滤后即得。

2.3 线性与范围 取空白血清1 ml，加入适量的RFP和RFT标准品，制得含药血清，使其浓度分别为:0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、16.0 和 32.0 μg/ml。按上述“2.2.3”项下处理，记录峰面积，用峰面积对内标峰面积的比值作纵坐标，血清样品的浓度作横坐标作直线回归，得RFP回归方程 Y=1.16 X－8.25(r=0.999 5)，最低检测限为 0.25 μg/ml;利福喷丁回归方程 Y=9.54 X+1.5(r=0.999 6)，最低检测限为 0.25 μg/ml。

2.4 精密度与回收率的测定 测定配制的RFP和RFT浓度分别为 0.5、4 和 16 μg/m l的标准血样，按“2.2.3”项下操作，测定其日内变异和日间变异及回收率，结果分别见表1和表2。

表1 利福平的精密度与回收率(n=5)

表2 利福喷丁的精密度与回收率(n=5)

2.5 样品测定 取“2.2.3”项下样品溶液60 μl，进样分析。色谱图见图1，结果见表3。

表3 利福平和利福喷丁样品测定结果

2.6 干扰试验 在空白血清中加入合并使用抗结核药异烟肼和比嗪酰胺，照样品相同方法处理测定，结果表明其对RFP和RFT的测定无干扰。

图1 空白血浆(A)样品血浆(B)HPLC测定谱图3 讨论

3.1 流动相的选择 在本试验中分别配制含不同比例甲醇的流动相，经多次实验，选用甲醇－水(67∶33)(用HAc调pH到7.0)作为流动相，能使RFP与RFT及内标较好的分离，三者出峰时间分别为2.9、3.8和 4.7 min ，出峰快，而且峰形较好。

3.2 内标物的选择 文献报道［2］选用地西泮、硝西泮及氯氮平为内标，但由于前两者和药峰分离不好，氯氮平对日光较敏感不易贮存而未选用，本文选用对硝基酚为内标，该物质结构稳定，易于获得，出峰快，与药峰分离较好，缩短了检测时间。

3.3 样品的处理 因RFP易被氧化为醌式RFP。因而选用直接沉淀法测定，沉淀剂后的上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样。RFP遇光易变质，水溶液易氧化，中性时最稳定。而在碱性条件下RFP很容易被氧化成醌式RFP，较强酸性条件下易被分解成3－甲酰利福霉素SV。因此本实验选用pH 7.0的流动相。

3.4 线性范围 RFP的治疗浓度范围为0.5～10 mg/L［3］、空腹一次服 RFT 400 mg，血药峰浓度约为16.8 μg/ml;在 4 ～ 12 h 间可保持 15.35 ～ 16.89 μg/ml;48 h 尚有 5.4 μg/ml，t1/2平均为 18 h，浓度均在线性范围之内，适用于本法测定。

综上所述，本实验采用反相高效液相色谱法建立了同时测定人血浆中RFP和RFT含量的方法，该分析方法，样品处理简单、快速，方法回收率高，重现性好。在实际工作中，对RFP和RFT先后进行治疗药物监测，则可以节省许多时间和试剂。

1 陈新谦，金由豫.新编药物学.第17版.北京:人民卫生出版社，2011:107－108

2 陈赛贞，袁国平，胡大平，等.反相高效液相色谱法测定人血中利福平浓度.药学实践杂志，2000，18(4):225

3 陈刚，谈恒山，卓海通，等.治疗药物监测.北京:人民军医出版社，1998:482