黄酮抑制血小板聚集及其构效的研究

郭一萌，郭春梅，刘淑清，鱼红闪，孙明忠

(1.大连医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁大连 116044;2.大连医科大学生物技术系，辽宁大连 116044;3.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)

黄酮抑制血小板聚集及其构效的研究

郭一萌1，郭春梅2，刘淑清1，鱼红闪3，孙明忠2

(1.大连医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁大连 116044;2.大连医科大学生物技术系，辽宁大连 116044;3.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)

［目的］比较8种黄酮对血小板聚集的抑制作用并探讨其构效关系。［方法］采用体外实验方法，测定黄酮类化合物对ADP诱导大鼠血小板聚集的抑制作用，并计算其抑制率。［结果］槲皮素、芦丁、异槲皮素、橙皮素、柚皮素、橙皮苷、柚皮苷和淫羊藿苷对血小板聚集的抑制率分别为(68.33±2.43)%、(55.34±2.09)%、(52.27±4.65)%、(50.80 ±7.03)%、(33.07 ±2.09)%、(31.28 ± 4.65)%、(22.91 ±1.68)% 和(20.94 ± 3.20)%，8 种黄酮类化合物对血小板聚集均呈现抑制作用。与对照组(不加黄酮类化合物)相比，差异均有显著性意义(P＜0.05)。［结论］黄酮类化合物对血小板聚集有明显抑制作用，A环C7位和C环C3位的羟基是该类化合物抑制血小板聚集发挥作用的重要功能基团。

黄酮类化合物;血小板聚集;结构;功能

心脑血管疾病严重威胁人类健康，其发生与血小板活化和血栓形成密切相关［1-2］。血小板是骨髓巨核细胞脱落的细胞碎片，呈圆盘形，没有细胞核，在体内通过黏附、聚集来参与止血过程。当血小板处于过于活化的病理生理状态时，就会发生黏附、聚集而促进血栓形成;若血栓存在于心脏或大脑血管中，造成心脑血管堵塞，就引发心梗、脑梗和中风［3-5］。抗血小板聚集是该类疾病防治的一个重要方面，但目前此类临床药物少且具有毒副反应。黄酮类化合物则被发现具有明显的抑制血小板聚集的作用，对心脑血管疾病的防治具有一定疗效［6-7］。

黄酮类化合物是一种天然多酚类植物化学物，具有多种生物学活性。其基本结构由两个苯环(A环和B环)通过中央3个碳原子相互连接，也即具有C6-C3-C6骨架的一系列化合物［8-9］。根据取代基团的不同可以分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮等［10-12］。黄酮类化合物结构上的差异会导致其生物学活性的变化［13-14］，其构效关系的揭示对药物的选用、开发和作用机制的研究具有重要意义。

本文系统研究了槲皮素(quercetin)、异槲皮素(isoquercitrin)、芦丁(rutin)、橙皮素(hesperetin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)和淫羊藿苷(icariin)(图1)对ADP诱导的大鼠血小板聚集的抑制作用，考察了黄酮类化合物不同取代基团对血小板聚集的抑制作用，初步确定黄酮类化合物发挥血小板聚集抑制作用的重要功能基团，为选择有效的该类化合物用于心脑血管疾病的防治提供一定实验依据和理论基础。

图1 8种黄酮化合物的结构式Fig 1 The chemical structures of eight flavonoids

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

二磷酸腺苷(ADP)购于 Sigma公司，纯度 ＞95%;其他试剂均为国产分析纯;LBY-NJ4血小板聚集仪为北京普利生仪器有限公司产品;成年雌性SD大鼠购于大连医科大学SPF动物实验中心。8种黄酮化合物均由大连工业大学鱼红闪教授提供。

1.2 8种黄酮化合物纯度分析

8种黄酮化合物各称取0.55 mg，分别用2 mL甲醇溶解，0.2 μm 过滤器过滤后，分别取 10 μL 样品用Waters 2690/996高效液相色谱仪检测其纯度。色谱条件:Intersil ODS-3 C18色谱柱 (4.6 ×250 mm);流动相:甲醇:0.2% 磷酸(60∶40);柱流速:1.0 mL/min;检测波长:槲皮素、异槲皮素、芦丁、柚皮素、柚皮苷为254 nm，橙皮素和橙皮苷为283 nm，淫羊藿苷为270 nm;柱温25℃。

1.3 血小板聚集抑制实验

新鲜血标本采自成年雌性SD大鼠，2周内未服用任何药物，空腹采集全血 20 mL，然后按 9∶1(血∶柠檬酸钠)体积比加入3.8%柠檬酸钠，800 rpm离心20 min，上清即为富含血小板血浆 (platelet rich plasma，PRP)，剩余部分在7000 rpm离心15 min，所得上清为缺乏血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)。取两只比色杯，分别加入PPP和PRP各300 μL，置于LBY-NJ4血小板聚集仪中37℃预热5 min。用PPP调零后测定PRP血小板数，将PRP与PPP混合使最终血小板数目为2.5×108/mL。在实验前将8种黄酮类植物化学物分别溶于DMSO中，终浓度为 331 μmol/L，与 450 μL 混合的血小板血浆在37℃温育3 min，然后加入3 μL 30 μmol/L的ADP诱导鼠血小板聚集，记录在60 s、180 s及300 s时的读数。定义最大透过率为T0，此时的血小板的相对聚集程度(%)为100，加入黄酮类化合物后样品的透过率T与之相比，按照公式(T0-T)/T0×100%，获得血小板的相对聚集程度 (RPA，%)。对照组不加黄酮类化合物，处理方法与实验组相同。所有数据为3次实验结果的平均值。

1.4 统计学方法

SPSS 11.5统计软件对实验数据进行统计分析，结果用均数±标准差(±s)表示，差异检验用方差分析和t检验，P＜0.05表示差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 黄酮纯度分析

通过计算槲皮素、芦丁、异槲皮素、淫羊藿苷、橙皮素、橙皮苷、柚皮素和柚皮苷的HPLC峰面积和峰强度，8种物质纯度均超过95%(表1)，黄酮类化合物是高纯度的，确保实验结果的可信度、准确性。

表1 8种黄酮化合物的纯度分析Tab 1 The purity determinations of eight flavonoids

2.2 黄酮对血小板聚集的抑制作用

不同种类的黄酮类化合物对血小板聚集的抑制作用不同。在相同浓度331 μmol/L时，8种黄酮类化合物对ADP诱导的大鼠血小板聚集均呈现出明显的抑制作用，与对照组(不加黄酮类化合物)相比，每一种黄酮类化合物对抑制血小板聚集程度的作用差异均有显著性意义，P＜0.05。其抑制率作用依次为:槲皮素 (68.33±2.43)% ＞芦丁(55.34 ±2.09)% ＞ 异槲皮素(52.27 ±4.65)% ＞橙皮素(50.80 ±7.03)% ＞ 橙皮苷(33.07 ±2.09)% ＞ 柚皮素(31.28 ±4.65)% ＞ 柚皮苷(22.91±1.68)% ＞淫羊藿苷(20.94 ±3.20)%(表2)。其中，异槲皮素和芦丁、橙皮素之间对抑制血小板聚集作用差异无显著性意义(P＞0.05);橙皮苷与柚皮素、柚皮苷与淫羊藿苷间对血小板聚集抑制作用也无显著性差异(P＞0.05)。其余各组之间对血小板聚集抑制作用差异均有显著性意义(P＜0.05)。

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3 讨 论

黄酮类化合物抑制血小板聚集的作用机制目前还不是很清楚，可能通过抑制血小板活化、5-羟色胺释放、血栓素A2(TxA2)形成、磷酸激酶C活化、Ca2+内流和释放以及阻断TxA2受体等来抑制血小板聚集［2，3，5，7，13，15-16］，但其具体作用机制尚不清楚，需进一步深入研究。

黄酮类化合物酚羟基数目越多，其抗血小板作用可能越强［5，13-14］。8种黄酮类化合物中，槲皮素含有5个酚羟基，其酚羟基数目最多，槲皮素也呈现出最强的抑制血小板聚集的能力。C环C3羟基对血小板聚集的抑制作用影响较大［5，13-14］。槲皮素与异槲皮素和芦丁的结构差异只在C环C3位的取代基不同，槲皮素为羟基，而异槲皮素和芦丁分别为O-β-Gl和O-Glc-α-Rha糖苷基，由于C环C3位羟基的缺失，异槲皮素和芦丁抑制血小板聚集的能力比槲皮素分别降低了～23.50%和～19.01%。结果表明:黄酮类化合物C环C3位羟基是发挥抑制血小板聚集功能的重要基团。A环C7羟基也是影响血小板聚集的重要基团［5，13-14］。橙皮素和橙皮苷、柚皮素和柚皮苷的结构差异仅在A环C7基团不同，橙皮素和柚皮素的A环C7羟基被双糖苷基O-β-Glc-α-Rha取代之后，其抑制血小板聚集的能力比橙皮素和柚皮素分别降低了～26.76%和～34.90%。说明黄酮类化合物A环上的C7羟基也是抑制血小板聚集的功能基团，其对抑制血小板聚集的贡献度大于C环C3位羟基。异槲皮素、芦丁和橙皮素抑制血小板聚集的作用相近，它们的结构差别在C环C2-C3双键结构、B环3’-4’邻位二羟基结构上，异槲皮素和芦丁C环为C2-C3双键结构而且具有3’-4’邻位二羟基结构，橙皮素C环C2-C3为单键，不具有3’-4’邻位二羟基结构。构效关系表明:C环C2-C3双键结构和B环3’-4’邻位二羟基结构对血小板聚集作用影响不大。

本实验的结果表明，酚羟基数目、A环C7位羟基和C环C3位羟基均影响黄酮类化合物的抗血小板聚集活性。本实验为选择有效的膳食黄酮类化合物防治心脑血管疾病及其应用提供了一定实验数据和理论依据。

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Structure-function study of flavonoid phytochemicals on platelet aggregation

GUO Yi-meng1，GUO Chun-mei2，LIU Shu-qing1，YU Hong-shan3，SUN Ming-zhong2
(1.Department of Biochemistry，Dalian Medical University，Dalian116044，China;2.Department of Biotechnology，Dalian Medical University，Dalian116044，China;3.School of Bioengineering，Dalian Polytechnic University，Dalian116034，China)

Abstract:［Objective］To compare the inhibitory effects of eight flavonoid phytochemicals on platelet aggregation and also explore the structure-function association.［Methods］The inhibitory effects of eight flavonoids on ADP-induced rat platelet aggregation were studied in vitro and obtained their inhibiting percentages.［Results］The results indicated that all the eight flavonoids including quercetin，rutin，isoquercitrin，hesperetin，naringenin，hesperidin，naringin and icariin could inhibit the ADP-induced rat platelet aggregation by(68.33 ±2.43)%，(55.34 ±2.09)%，(52.27 ±4.65)%，(50.80 ±7.03)%，(33.07 ±2.09)%，(31.28 ±4.65)%，(22.91 ±1.68)%and(20.94 ±3.20)%.［Conclusion］The apparent inhibitory effects of flavonoids on platelet aggregation are potentially associated with their intrinsic structures.The 7-OH group of A ring and 3-OH group of C ring were important for its antiplatelet function.

Key words:flavonoids;platelet aggregation;structure;function

Q956

A

1671-7295(2012)05-0424-04

国家自然科学基金(81100722，81171957);辽宁省教育厅科研项目(2008S077);辽宁省自然科学基金(20082158)

2012-03-26;

2012-08-14

郭一萌 (1983-)，女，山西太原人，研究生，硕士。E-mail:smzlsq@yahoo.com

孙明忠，教授，博士。E-mail:mxs288@gmail.com