柚皮素脂质体对非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质代谢的影响及机制研究*

唐晓飞，钟梦菊，沈海娟

本研究观察了柚皮素脂质体对非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)大鼠脂质代谢和肝组织病理学变化的影响，以期为NAFLD的治疗提供帮助，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、药品与试剂 SPF级雄性SD大鼠50只，购自武汉华联科生物科技有限公司【动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0019】，昼夜交替周期为12 h，给予充足水和普通饲料，适应性饲养1 w。全自动生化分析仪(日本日立公司)、紫外分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)、酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)、电泳仪(武汉纯度生物科技有限公司)。柚皮素及相应的柚皮素脂质体由上海机纯实业有限公司提供。检测试剂盒均购自上海闪谱生物科技有限公司。Nrf2 mRNA和β-actin均购自瑞士Roche公司，Nrf2 mRNA：正向TGAAGCTCAGCTCGCATTGA，反向TGCTCCAGCTCGACAATGTT；β-acton：正向TGAGCTGCGTTTTACACCCT，反向GCCTTCACCGTTCCAGTTTT。

1.2 模型构建 随机将大鼠分为5组，即对照组、模型组、柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组。除对照组大鼠不予特殊处理外，其余4组大鼠均采用高糖高脂饲料饲养12 w。在柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组，分别给予柚皮素30 mg·kg-1.d-1、柚皮素脂质体20 mg·kg-1.d-1和柚皮素脂质体30 mg·kg-1.d-1腹腔注射；给予模型组大鼠等量生理盐水腹腔注射。在12 w末，处死大鼠，取肝组织称质量及行病理学检查。

1.3 指标检测 使用全自动生化分析仪检测血生化指标；采用ELISA法检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平；采用Western blot法检测肝组织Nrf2蛋白表达，并采用RT-PCR法检测肝组织Nrf2 mRNA水平。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量和肝质量比较 在12 w末，柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠体质量和肝质量均显著低于模型组(P<0.05)；柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠体质量和肝质量均显著低于柚皮素组和柚皮素脂质体Ⅰ组(P<0.05，表1)。

表1 各组大鼠体质量和肝质量比较

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与柚皮素组比，③P<0.05；与柚皮素脂质体Ⅰ组比，④P<0.05

2.2 各组肝组织学变化 对照组大鼠肝细胞排列紧密，细胞内未见脂肪颗粒；模型组大鼠肝细胞大小不一，有大量脂肪颗粒沉积，且伴有炎性细胞浸润；柚皮素组和柚皮素脂质体Ⅰ组大鼠肝细胞脂肪颗粒较小，存在较轻的炎性细胞浸润；柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝细胞排列紧密，细胞大小均一，与对照组大鼠肝组织学表现相近(图1)。

2.3 各组血生化指标比较 柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠血清TC、TG、ALT和AST水平均显著低于模型组(P<0.05)；柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠血清TC、TG、ALT和AST水平均显著低于柚皮素组(P<0.05，表2)。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现 (HE，400×)

例数TC(mmol/L)TG(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)对照组100.8±0.11.8±0.240.0±6.3133.4±8.4模型组101.2±0.2①2.6±0.2①69.8±5.3①229.6±18.2①柚皮素组101.0±0.1①②2.2±0.1①②52.6±5.2①②156.8±11.2①②柚皮素脂质体Ⅰ组100.9±0.1①②2.1±0.2①②③51.5±4.8①②149.4±9.9①②柚皮素脂质体Ⅱ组100.8±0.1②③1.9±0.1②③④45.4±4.3①②③④143.6±6.5②③

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与柚皮素组比，③P<0.05；与柚皮素脂质体Ⅰ组比，④P<0.05

2.4 各组血清SOD、CAT和MDA水平比较 柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠血清SOD和CAT水平显著高于，而MDA水平显著低于模型组(P<0.05)；柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠血清SOD和CAT水平显著高于，而MDA水平显著低于柚皮素组和柚皮素脂质体Ⅰ组(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠血清SOD、CAT和MDA水平比较

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与柚皮素组比，③P<0.05；与柚皮素脂质体Ⅰ组比，④P<0.05

2.5 各组大鼠肝组织Nrf2蛋白表达情况比较 对照组、模型组、柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2蛋白表达水平分别为(1.4±0.3)、(0.4±0.1)、(0.8±0.1)、(0.8±0.2)和(1.3±0.2)，差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2蛋白水平均显著高于模型组(P<0.05)，柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2蛋白水平显著高于柚皮素组和柚皮素脂质体Ⅰ组(P<0.05，图2)。

图2 各组大鼠肝组织Nrf2蛋白表达情况

2.6 各组大鼠肝组织Nrf2 mRNA水平变化比较 对照组、模型组、柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2 mRNA水平分别为(1.0±0.1)、(0.4±0.1)、(0.7±0.1)、(0.7±0.1)和(0.9±0.1)，差异有统计学意义(P<0.05)。柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2 mRNA水平均显著高于模型组(P<0.05)，柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2 mRNA水平显著高于柚皮素组和柚皮素脂质体Ⅰ组(P<0.05)。

3 讨论

随着人们生活水平的改善、不良饮食习惯的盛行及生活节奏的加快，我国NAFLD的发病率逐年攀升，且有向年轻化趋势发展，严重影响着人们的健康[1-4]。目前，关于NAFLD的预防、治疗和发病机制的研究已成为近年来研究的热点[5-7]。但至今，有关NAFLD的发病机制仍未完全阐明[8-10]。多数学者认同“二次打击”学说，认为肝细胞内脂肪颗粒堆积，超出肝脏清除脂肪的能力时，肝脏细胞会发生氧化应激反应，进而出现胰岛素抵抗、脂质过氧化及糖脂代谢紊乱等[11-13]。本文通过探讨柚皮素脂质体对NAFLD大鼠的保护作用，以期为NAFLD的治疗做出新的研究。

本研究用高糖高脂饲料饲养大鼠，经过12周饲养，检测各组大鼠体质量、肝质量和血清TC、TG、ALT、AST水平，结果发现模型组大鼠体质量、肝质量和血清TC、TG、ALT、AST水平均显著高于对照组，且经病理学检查观察肝组织结构，发现模型组大鼠肝细胞内有大小不等的脂肪颗粒堆积，炎性细胞浸润，以上结果均表明NAFLD大鼠模型构建成功。通过腹腔注射柚皮素和柚皮素脂质体，发现柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠体质量、肝质量和血清TC、TG、ALT、AST水平均较模型组大鼠大幅降低，表明柚皮素可有效调节大鼠脂质代谢，保护肝脏，且柚皮素脂质体剂型效果更好，随着给药剂量的增加，其效果越明显。近年来，有研究[14-16]发现Nrf2与NAFLD发病密切相关，其在NAFLD发病及疾病进展过程中发挥着重要的作用。

Nrf2是亮氨酸拉链转录因子家族成员之一，在机体内普遍存在，主要负责调控组织或细胞防御氧化应激，促进SOD和CAT等抗氧化因子的生成[17-20]。本研究结果表明模型组大鼠肝组织Nrf2蛋白表达较对照组降低，差异有统计学意义。经腹腔注射柚皮素和柚皮素脂质体后，大鼠肝组织Nrf2蛋白表达有不同程度的升高，以柚皮素脂质体Ⅱ组升高更为明显。进一步采用RT-PCR法检测大鼠肝脏Nrf2 mRNA水平，结果显示模型组大鼠肝组织Nrf2 mRNA水平最低，而柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠肝组织Nrf2 mRNA水平均有不同程度的升高，且以柚皮素脂质体Ⅱ组升高更为明显。通过检测5组大鼠血清SOD、CAT和MDA水平，我们发现柚皮素组、柚皮素脂质体Ⅰ组和柚皮素脂质体Ⅱ组大鼠血清SOD和CAT水平均显著高于模型组，而血清MDA水平显著低于模型组。以上结果提示，柚皮素可能通过激活Nrf2表达，促进SOD和CAT的生成，进而抑制肝细胞氧化应激损伤，发挥了保护肝脏的作用。