口腔扁平苔藓中MMP-2和MMP-9的表达及意义

浦光瑞，张 虹

(大连医科大学附属第一医院口腔科，辽宁大连 116011)

口腔扁平苔藓中MMP-2和MMP-9的表达及意义

浦光瑞，张 虹

(大连医科大学附属第一医院口腔科，辽宁大连 116011)

［目的］探索MMP-2和MMP-9与口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)的发生、发展乃至癌变潜能的关系。［方法］采用免疫组化SP法检测MMP-2和MMP-9在22例OLP、11例正常口腔黏膜组织、22例白斑和22例口腔鳞癌组织表达。［结果］在正常口腔黏膜、扁平苔藓、白斑和鳞癌组织中MMP-2和MMP-9的表达依次增加。MMP-2和MMP-9在口腔扁平苔藓和白斑中的表达显著高于正常口腔黏膜 (P＜0.05)，但在口腔扁平苔藓和白斑间的表达差异无显著性意义(P＞0.05);在鳞癌中的表达显著高于其他3组 (P＜0.05)。［结论］MMP-2和MMP-9表达与OLP的发生、发展乃至癌变潜能有关。

基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶9;扁平苔藓;口腔

口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)是发生在口腔黏膜的一种慢性、浅表性炎症损害，因其长期糜烂有恶变倾向，WHO将其列入癌前状态，癌变率在1%左右［1］。其病因和癌变原因目前仍不明了。临床对于判断OLP是否发生癌变主要依靠光镜下的形态学标准，因此从分子水平上探寻有助于判断病变组织良恶性程度的标记物已成为口腔医学研究的热点。基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)能够特异性的降解基底膜的成分。基底膜中最主要的稳定成分是Ⅳ型胶原，只有Ⅳ型胶原酶能降解Ⅳ型胶原，破坏基底膜的完整性。MMPs中的明胶酶是惟一能够降解细胞外基质(extracelluar matix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)中IV型胶原的酶，它包括MMP-2和MMP-9，其作用底物几乎覆盖了所有基底膜成分，是研究基底膜损伤最重要的一组酶［2］。本实验采用免疫组化法，检测MMP-2和MMP-9在OLP中的表达，并用正常口腔黏膜(normal oral mucosa，NOM)、白斑(oral leukoplakia，OLK)和口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)作对照，研究MMP -2和MMP-9与OLP的发生发展乃至癌变潜能的关系。

1 材料和方法

1.1 实验对象

选取大连医科大学附属第一医院口腔科2009—2010年经病理科确诊的22例OLP患者的病变黏膜组织为研究对象，以11例NOM(肿瘤边界1 cm外的癌旁组织来源于拔牙患者、外伤患者和唇腭裂患者)，22例OLK和22例OSCC对照。患者均知情同意。

1.2 实验试剂

兔抗人基质金属蛋白酶2多克隆抗体和兔抗人基质金属蛋白酶9多克隆抗体(中杉金桥试剂公司);快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(福州迈新生物技术开发有限公司产品);柠檬酸组织修复液(福州迈新生物技术开发有限公司产品);DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司产品)

1.3 实验方法

组织经10%福尔马林液固定，石蜡包埋，10 μm厚连续切片。3%双氧水孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶的活性，1%柠檬酸于高压锅内抗原热修复2 min，5%正常牛血清孵育15 min以阻断非特异背景反应;滴加一抗，室温孵育60 min;滴加即用型快捷免疫组MaxVision试剂，室温孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，封片。

1.4 结果判定

采用独立双盲法观察结果，用PBS代替一抗作为阴性对照。染色阳性以细胞浆或胞膜呈现棕黄至棕褐色为标准，按半定量方法判定其表达强度(按照参照文献［3］进行评分)。根据细胞着色强度分为:无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;每张切片随机选择10个400倍视野计算细胞总数和阳性表达的细胞个数，得出细胞表达百分率:无阳性细胞为0分，阳性细胞数占1% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，﹥75%为4分。两项结果相加:0～2分为阴性，≥3分者为MMP-2和MMP-9阳性。

1.5 统计学方法

应用SPSS12.0统计软件。各组阳性率差异比较采用行×列χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

MMP-2在NOM染色较浅大多呈阴性表达;OLP和OLK中在上皮基底层阳性表达;在OSCC阳性表达显著增强，在基底膜附近的肿瘤细胞和癌巢染色更为明显，癌巢周围间质也有中等程度的染色(表1、图1)。MMP-9在NOM染色较浅大多呈阴性表达;OLP中主要在上皮基底层阳性表达，还有少量在固有层的炎性浸润细胞阳性表达;OLK中在上皮基底层阳性表达;在OSCC阳性表达显著增强，在基底膜附近的肿瘤细胞和癌巢染色更为明显，癌巢周围间质也有中等程度的染色(表2、图2)。

表1 MMP-2在NOM、OLP、OLK和OSCC中表达的细胞数比较Tab 1 The expression of MMP -2 in NOM、OLP、OLK and OSCC in cell number comparison (n)

表2 MMP-9在NOM、OLP、OLK和OSCC中表达的细胞数比较Tab 2 The expression of MMP -9 in NOM、OLP、OLK and OSCC in cell number comparison (n)

在OLP、OLK、OSCC中 MMP-2和 MMP-9的表达依次增强，且与NOM比较差异均有显著性意义(P＜0.05)。OLP和OLK两组之间比较差异无显著性意义(P＞0.05)，但与OSCC比较差异均有显著性意义(P ＜0.05)。

3 讨 论

基底膜改变是OLP病损的特征学改变，损伤的基底膜一旦失去了支撑作用，基底细胞就会脱落，导致发生基底细胞的液化变性，因此基底膜的损伤在口腔扁平苔藓发病中有很重要作用。Ⅳ型胶原是基底膜中最主要成分，其数量减少或功能异常时可影响基底膜的生理功能及细胞功能，也是肿瘤细胞浸润扩散过程中的一道天然屏障［4］。

本研究中MMP-2和MMP-9在NOM有很少量表达，并与OLP差异有显著性意义(P＜0.05)。这可能是一种正常生理状态下的持续弱阳性表达，正常组织通过严格调控MMP-2和MMP-9基因的正常表达来维持与它们各自的特异性抑制剂TIMP-2和TIMP-1之间的平衡，从而使基底膜的合成和降解达到了平衡稳定状态［5］。

MMP-2和MMP-9在OLP中的阳性表达低于OLK，这与OLP没有上皮异常增生而OLK有上皮异常增生的病理特征相吻合。但两组间差异无显著性意义，原因可能是实验样本例数不足或选取的OLK组织异常增生的程度较轻。从OLP、OLK至OSCC中MMP-2和MMP-9的阳性表达率依次增加，说明两者在有异常增生上皮组织中的表达强于无异常增生组织(OLK和OSCC高于OLP)，且随着异常增生程度的加重而表达增强。MMP-2和MMP-9在OLP的阳性表达介于NOM和OSCC之间，并且差异有显著性意义，说明口腔扁平苔藓尚未进展到癌，但仍具有一定的癌变倾向，这为解释临床上大多数口腔扁平苔藓生物学行为较好，仅有极少部分病例不断发展甚至癌变提供了一定的理论依据。

本实验在OLP中MMP-9的阳性细胞还有少部分在炎性浸润的黏膜固有层中表达，其原因可能有两点:一是抗原特异性的CD8+T淋巴细胞可以分泌MMPs和它们的抑制剂(tissue Inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)，在OLP固有层的炎性浸润组织中，兼有MMP-9和TIMP-1mRNA表达能力的T细胞在受到细胞因子的刺激后，使 T细胞表达MMP-9mRNA的水平升高，而TIMP-1则缺乏这种变化，导致MMP-9与TIMP-1之间平衡失调，因MMP-9相对于TIMP-1的过表达，使TIMP-1抑制MMP-9的作用减弱，从而MMP-9的降解作用增强。二是MMP-9激活以后，降解了的基底膜，还可以使更多的T细胞沿着基底膜缺损处进入上皮而加剧上皮基底膜的损伤［6］，T细胞穿过基底膜的迁移活动和T细胞衍生的MMPs有关。Smllor等［7］实验证明浸润的T淋巴细胞可以引起基底膜的损伤，损伤的基底膜又可以加重扁平苔藓的病理改变。Sugerman等［8］认为抗原特异性和非特异性机制均可引起基底膜的损伤，两种机制的共同归宿就是MMPs引起基底膜的损伤。由此推测T细胞来源的MMP-9可能参与了OLP的发病。

有研究表明角质形成细胞需要基底膜衍生细胞的存活信号来阻止细胞凋亡的发生。因此推测本实验中在MMP-2和MMP-9导致OLP上皮基底膜的破坏之后，损坏的基底膜无法提供生存信号给角质形成细胞，从而继发角质形成细胞的细胞凋亡，而凋亡的角质形成细胞分泌基底膜结构蛋白的能力大大降低，不能修复受损基底膜，使基底膜的损伤加剧。所以，基底膜的损伤与其继发引起的角质形成细胞凋亡，两种过程相互促进，导致OLP的慢性进程。

本实验中MMP-2和MMP-9在OSCC的阳性表达显著高与其他3组，其原因可能是在OSCC中MMP-2和MMP-9在肿瘤细胞和间质细胞中均有分布，并在癌巢周边表达明显增多，提示癌巢边缘细胞增生活跃，能诱导MMP-2和MMP-9的产生，降解细胞外基质和癌巢基底膜，因而具有较高的侵袭潜能;但在OLP和白斑中主要定位于上皮细胞中，间质细胞表达很少，提示MMP-2和MMP-9的激活是参与细胞癌变的因素之一，当细胞癌变后，肿瘤细胞能分泌或诱导间质细胞分泌大量的MMP-2和MMP-9，破坏基底膜和细胞外基质的降解平衡，从而促进癌细胞突破基底膜和细胞外基质构成的组织学屏障，侵袭周围组织和深层组织，重新塑造局部微环境［9］，达到侵袭和转移的目的。Jordan等［10］曾报道MMPs可能是口腔上皮异常增生恶性转化的一个有用指标，其可能的机制是MMP和P53的突变存在联系。

本研究提示，MMP-2和MMP-9在OLP中的表达上调是其发生发展乃至癌变的分子基础，MMP-2和MMP-9的水平变化有可能成为扁平苔藓的诊断、预后和判断癌变的动态指标之一。此外TIMPs可以抑制MMPs的活性，在正常生理状态下MMPs与TIMPs协同产生而维持动态平衡，但当此平衡被打破时，ECM和BM的代谢异常可导致疾病的发生并促进恶化。

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［1］贺东暾，董旭，陈蓉.口腔扁平苔藓癌变临床观察［J］.中国误诊学杂志，2004，4(1):881.

［2］金晓明，李雅馨.血管内皮生长因子对口腔鳞癌细胞系基质金属蛋白酶-2和-9活性的影响［J］.口腔医学，2004，24(2):65 -67.

［3］Shimizu M，Saitoh Y，Itoh H.Immunohistochemical staining of Haras oncogene product in normal，benign，and malignant human pancreatic tissues［J］.Hum Pathol，1990，21(6):607-612.

［4］马军花，于芹芹.IV型胶原、MMP-2及TIM P-2在妊高征胎盘组织中的表达及意义［J］.山东医药，2007，47(11):45-46.

［5］李文荟，郭莉，谭耀文，等.口腔癌及癌前病变组织中MMP-9基因表达的意义［J］.临床口腔医学杂志，2007，23(1):27 -28.

［6］Xijing J，Philip B.Intra2epithelial CD8 + Tcells and basement membrane disruption in oral lichen plans［J］.J Oral Pathol Med，2002，31:1 -23.

［7］Smllor BR，Schach CP，Hudson AR，et al.Immunohistochemical stains in dermatopathology［J］.American J Dermatol，2000，43(6):1094 -1100.

［8］Sugerman PB.Disease mechanism in oral lichen planus:a possible role for autoimmunity［J］.Australia J Dermatol，1993，34(2):63 -69.

［9］Vaalamo M，Mattila L，Johansson N，et al.Distinct populations of stromal cells express collagenase-3(MMP-13)and collagenase-1(MMP-1)in chronic ulcers but not in normally healing wounds［J］.J Invest Dermatol，1997，109:96.

［10］Jordan RC，Macabeo-Ong M，Shiboski CH，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase-1 and-9 mRNA is associated with progression of oral dysplasia to cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10:6460 -6465.

Expression and significance of oral lichen planus in MMP-2 and MMP-9

PU Guang-rui，ZHANG Hong
(Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To Explore the relationshiops of MMP-2 and MMP-9 to the OLP occurrence，the development and even the canceration potential.［Methods］Immunohisto- chemistry was performed to examine expressions of MMP -2 and MMP -9 in 22 OLP，11 normal oral mucosa，22 oral leukoplakia and 22 squamous cell carcinoma.［Results］The expression of MMP-2 and MMP-9 increased in turn from normal oral mucosa to OLP，oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma tissues.The expression of MMP-2 and MMP-9 in OLP and oral leukoplakia was significantly higher than that in normal oral mucosa(P＜0.05)，there was significant difference;There was no significant difference between the positive expression of MMP-2 and MMP-9 in OLP and oral leukoplakia(P＞0.05);The expression of MMP-2 and MMP-9 in squamous cell carcinoma was significantly higher than The other three groups(P＜0.05)，there was significant difference.［Conclusion］The expression levels of MMP-2 and MMP-9 correlate with the occurrence of oral lichen planus，development and even cancer potential，which may be useful indicator to judge the possibility of malignant change of OLP.

Key words:matrix metalloproteinase-2;matrix metalloproteinase-9;lichen planus;oral

R781.5+9

A

1671-7295(2012)05-0446-04

2012-04-18;

2012-08-10

浦光瑞(1982-)，女，辽宁大连人，主治医师。E-mail:puguangruiliu@sina.com