IL-4、IL-13在慢性综合应激模型大鼠Cajal细胞损伤中的作用

邓 琴，陈明锴，张 丽，罗和生

武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉 430060

IL-4、IL-13在慢性综合应激模型大鼠Cajal细胞损伤中的作用

邓 琴，陈明锴，张 丽，罗和生

武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉 430060

目的 观察慢性综合应激模型大鼠中IL-4及IL-13的表达变化，并初步探讨其在Cajal细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)损伤中的作用。方法 健康成年SD雄性大鼠20只，随机分为实验组和对照组，每组10只，实验组大鼠制备慢性综合应激模型，旷场实验鉴定造模成功后，采用ELISA法测定血清IL-4、IL-13的浓度，免疫荧光法观察肠道肌间神经丛TMEM16A的表达与分布。结果 模型组和对照组大鼠血清IL-4浓度分别为(8.09±0.97)pg/mL和(6.98±0.69)pg/mL，差异有统计学意义(t=3.363，P＜0.01)，血清 IL-13 浓度分别为(5.96 ±0.67)pg/mL 和(5.26 ±0.73)pg/mL，差异有统计学意义(t=2.322，P ＜0.05);荧光显微镜下观察肠道平滑肌间神经丛TMEM16A有阳性表达，模型组在不同节段肠道肌间神经丛为阳性表达的细胞减少且分布稀疏。结论 慢性综合应激时，IL-4、IL-13等Th2免疫应答相关炎性因子产生增加，其可能通过调控TMEM16A表达参与了ICC的损伤。

IL-4;IL-13;慢性综合应激;TMEM16A;ICC

胃肠运动异常和内脏高敏感是功能性胃肠病(functional gastrointestinal disorders，FGIDs)的主要临床表现，而ICC是胃肠运动的起搏细胞，是慢波活动的基础。当前，FGIDs发病率逐年上升，研究证实，不良心理社会因素与FGIDs发生密切相关。FGIDs发病过程中存在各种胃肠激素、神经递质、炎症介质等生物活性物质的变化［1］，文献报道与我们的前期研究表明，炎性细胞因子可损伤ICC网络结构及功能、影响ICC与神经末梢间信号转导，但其作用途径及方式并不清楚［2］，本研究拟观察慢性综合应激模型大鼠血清中IL-4及IL-13的表达变化并初步探讨其在Cajal细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠20只，体质量250～300 g，来自武汉大学实验动物中心。

1.2 试剂与仪器 大鼠IL-4、IL-13 ELISA试剂盒均由武汉洁洋盛生生物科技有限公司提供，TMEM16A免疫荧光抗体由武汉三鹰生物科技有限公司提供，加样步骤严格按说明书进行。主要实验仪器:酶标仪(美国伯乐天呈北京分公司);自动酶标洗板机(上海福玛实验仪器有限公司);自动平衡离心机(北京医用离心机厂);电热恒温水箱(北京长安科学仪器厂);切片机(上海徕卡仪器有限公司);脱水机(武汉俊杰电子有限公司);包埋机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组:健康成年SD雄性大鼠20只，体质量250～300 g。为适应环境，先在自由饮食、每日光/暗周期各12 h交替、背景噪音为(40±10)Db、温度20℃条件下饲养1周，然后随机分为对照组和模型组，每组10只。

1.3.2 造模及鉴定:参照文献［3］，采用经典慢性综合应激致抑郁模型方法。制作方法:大鼠先适应性喂养1周，再接受21 d各种不同的应激，包括冰水游泳(4 ℃，5 min)、热应激(45 ℃，5 min)、摇晃(1 次Ps，15 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(48 h)、足底电击(电流强度1 mA，间隔1 min刺激1次，共30次)，每种刺激2～3次并且相邻2 d刺激种类不同。鉴定:造模前后进行旷场实验鉴定造模是否成功。旷场大小为120 cm×90 cm×35 cm，将大鼠放入正中点，观察大鼠的活动情况3 min。测定指标包括:(1)水平和垂直穿越总距离;(2)直立次数(两前肢离地1 cm以上的次数);(3)粪便次数(因为本次实验中大鼠每次排便均为1粒，故以粪便粒数表示粪便次数，此指标由观察者自行记录)。

1.3.3 血清的采集与组织取材:造模成功后，处死动物，心房取血5 mL，装入洁净的试管中，室温静置1 h，40℃过夜。1500 r/min离心30 min，吸取上部血清，－70℃保存备用。剖腹后迅速分离并剪取肠道组织，取材后制作石蜡切片备用。

1.3.4 IL-4、IL-13测定:采用双抗体夹心 ELISA 法测定血清IL-4、IL-13含量。检测过程按照试剂盒说明书操作。主要步骤:(1)酶标的生物素抗体;(2)加入酶的底物发生显色反应;(3)酶标仪450 nm读取吸光度;(4)通过标准品曲线计算样品的IL-4和IL-13的含量。

1.3.5 TMEM16A表达及分布检测:采用免疫荧光法观察TMEM16A在肠道肌间神经丛表达及分布。石蜡切片脱蜡，用PBS冲洗后置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10 min低火至沸。自然冷却并用PBS洗涤后放入3%过氧化氢溶液中，室温下孵育10 min。PBS洗涤后用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭20 min。甩干BSA液加入约50 μL适当稀释的一抗(TMEM16A sc135235，1∶200)覆盖到组织，4℃过夜。PBS洗涤后加入50～100 μL兔抗荧光二抗，避光室温下孵育50 min～1 h。避光PBS洗涤后加入50～100 μL Hoechst避光染核5 min。PBS洗涤稍甩干后抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存待拍照用。1.4统计学方法实验结果以¯x±s表示，计量资料的比较采用t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性综合应激对大鼠生物学行为的影响 采用旷场实验检测实验动物的生物学行为。给予慢性综合应激，两组大鼠旷场实验各项指标无明显差异(P＞0.05)。给予慢性综合应激21 d后，进行旷场实验鉴定，模型组大鼠水平和垂直穿越总距离反映兴奋性减少(P＜0.05，t=2.532);直立次数反映对环境的适应程度减少(P＜0.01，t=3.405);粪便粒数反映紧张程度增多(P ＜0.05，t=3.144，见表1)。提示受慢性综合应激刺激的大鼠出现抑郁症状，即造模成功。

表1 慢性综合应激刺激21 d后两组大鼠旷场试验结果比较±s)Tab 1 Comparison of open-fieldResultsfrom the model group and control group after 21-day chronic and comprehensive stress induction(¯x ± s)

表1 慢性综合应激刺激21 d后两组大鼠旷场试验结果比较±s)Tab 1 Comparison of open-fieldResultsfrom the model group and control group after 21-day chronic and comprehensive stress induction(¯x ± s)

与对照组相比较，*P＜0.05

组别 穿越总距离(cm)直立次数 粪便粒数对照组1433.2 ±633.21 21.5 ±7.99 0.9 ±0.74模型组 905.3 ±340.07* 12.3 ±5.54* 2.5 ±1.65*

2.2 慢性综合应激对大鼠血清IL-4、IL-13含量的影响 慢性综合应激模型大鼠和对照组大鼠血清IL-4浓度分别为(8.09 ±0.97)pg/mL 和(6.98 ±0.69)pg/mL，模型组高于对照组(P＜0.01，t=3.363);血清 IL-13浓度分别为(5.96±0.67)pg/mL 和(5.26 ±0.73)pg/mL，模型组高于对照组(P ＜0.05，t=2.322)。

2.3 慢性综合应激对大鼠肠道肌间神经丛TMEM16A表达和分布的影响 运用免疫荧光方法在荧光显微镜下观察，模型组和对照组大鼠肠道肌间神经丛均可见TMEM16A表达阳性的细胞散在分布，且模型组在不同节段肠道肌间神经丛表达为阳性的细胞数量减少且分布稀疏(见图1)。

3 讨论

不良心理社会因素与FGIDs的发生密切相关。我们前期有关慢性综合应激致抑郁模型大鼠的研究提示，慢性综合应激大鼠表现出肠道运动异常、大便性状改变并伴有ICC超微结构和网络结构的损伤［4］。有文献［2］报道，炎性细胞因子可损伤ICC网络结构及功能，影响ICC与神经末梢间信号转导，但其作用途径及方式并不清楚。本研究采用慢性综合应激致抑郁的方法，通过长期、慢性、不可预见的刺激模拟不良心理社会因素暴露，研究模型大鼠血清中IL-4及IL-13的表达变化，并初步探讨其引起ICC损伤的可能途径及作用，为进一步探讨FGIDs发病机制提供理论依据。

图1 对照组及模型组大鼠回肠、空肠、近段结肠、远端结肠肌层TMEM16A表达(荧光显微镜200×)A:正常组大鼠回肠肌层TMEM16A表达;B:模型组回肠肌层TMEM16A表达;C:正常组空肠肌层TMEM16A表达;D:模型组空肠肌层TMEM16A表达;E:正常组大鼠远端结肠肌层TMEM16A表达;F:模型组大鼠远端结肠肌层TMEM16A表达;G:正常组大鼠近端结肠肌层TMEM16A表达;H:模型组大鼠近端结肠肌层TMEM16A表达Fig 1 The expression of TMEM16A in the muscular layer of the ileum/the jejunum/the distal colon/the proximate colon of rats in the control group and the model group(fluorescence microscope 200×)A:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the ileum of rats in the control group;B:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the ileum of rats in the model group;C:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the jejunum of rats in the control group;D:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the jejunum of rats in the model group;E:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the distal colon of rats in the control group;F:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the distal colon of rats in the model group;G:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the proximate colon of rats in the control group;H:The expression of TMEM16A in the muscular layer of the proximate colon of rats in the model group

白细胞介素4(Interleukin 4，IL-4)和白细胞介素13(Interleukin 13，IL-13)主要由Th2型T辅助淋巴细胞产生，其结构相似，共受体和信号途径都通过结合靶细胞上的功能性受体发挥生物活性，且二者的生物学功能在许多方面有相似之处。研究显示［5］，在肠道急性感染期，肠道肌层 IL-4、IL-13、TGF-β1、还氧化酶(cyclooxygenase 2，COX-2)表达增加，Kindt等［6］也发现FGIDs患者体内呈现以IL-5、IL-13等Th2细胞因子为主的炎症反应，本研究发现慢性综合应激模型大鼠血清中IL-4、IL-13等Th2免疫应答相关炎性因子增加，其中血清IL-4水平明显增高与Pecaut对失重大鼠抑郁模型的研究结果一致［7］;另有研究发现［2］，炎症细胞可能通过释放大量炎症因子作用于ICC细胞，破坏ICC网络结构及功能，影响胃肠道运动，此外，炎症细胞浸润肠道肌层还可导致ICC与神经末梢间信号转导障碍，影响平滑肌收缩;我们前期研究也发现，慢性综合应激模型大鼠中ICC的超微结构、ICC网络损伤可能与炎性因子有关［4］。上述研究提示，慢性综合应激时IL-4、IL-13等Th2免疫应答相关炎性因子增加可能参与了ICC损伤所引起的胃肠道异常运动。

TMEM16A是一种最近发现的跨膜蛋白，是钙离子激活氯通道的结构亚单位，而钙离子激活氯通道是维持ICC正常生理功能产生起搏电位的最重要环节，此外，TMEM16A还是ICC选择性分子标志物，在胃肠道TMEM16A仅表达于ICC而不表达在平滑肌细胞和肌间的肥大细胞上，因此能更准确地反映ICC的数量、分布及其网络结构。本研究发现在荧光显微镜下肠道肌间神经丛TMEM16A表达阳性的细胞减少且分布稀疏，一定程度上反映了ICC数量、形态、结构发生的变化或破坏。

目前已知，IL-4、IL-13可正反馈调节由Th2分化的特异性信号转导子和转录激活子6(signal transducers and activators of transcription，STAT6)，使其产生新的Th2细胞因子IL-4、IL-13。并且STAT6第641位为酪氨酸残基，其磷酸化在IL-4诱导的STAT6激活中起着关键作用，当IL-4与特异性受体结合后，可活化酪氨酸激酶系统(JAKs)，引起酪氨酸残基磷酸化而诱导特定基因的表达及其蛋白质合成。JAK/STAT信号传导通路是众多细胞因子信号传递过程中的重要环节，在哮喘所致气道炎症、气道重塑等过敏性表现中发挥着关键作用;IL-4引起气道平滑肌收缩也被证明与JAK/STAT 通路相关。有学者证实［8］，IL-4、IL-13 可激活气道上皮细胞中STAT6刺激上皮细胞增生，促进合成和分泌大量黏液。另有研究［9］发现，旋毛虫感染后PI-IBS模型小鼠肠道平滑肌的高收缩性具有STAT6依赖性。据此推测，L-4、IL-13等Th2相关炎性因子对ICC损伤所致肠道平滑肌异常收缩，可能与JAK/STAT信号转导通路有一定的联系，但其具体机制尚不明确。Caputo等［10］发现用浓度为10 ng/mL的IL-4刺激支气管上皮细胞24 h后，可在基因转录水平诱导TMEM16A的表达增加。另有研究［11］发现，TMEM16A mRNA在小鼠空肠肠肌层(Auerbach’s plexus，ICCAP)和深肌间(deep muscular plexus，ICC-DMP)ICC明显高表达，而慢波活动起源于ICC-AP，故TMEM16A可能参与肠道起搏电流的形成。通过进一步研究TMEM16A基因敲除小鼠发现［12］，敲除 TMEM16A基因后，模型小鼠胃平滑肌收缩的频率和振幅明显下降，且出现节律紊乱，该研究提示，TMEM16A的表达与胃肠功能异常运动密切相关。

综上所述，慢性综合应激所致抑郁时，模型大鼠血清中Th2免疫应答相关炎性因子IL-4、IL-13水平显著性增高，其可能通过JAK/STAT信号转导通路导致TMEM16A表达异常，再通过TMEM16A的介导引起ICC损伤，最终出现类似于临床的胃肠道运动功能障碍。而IL-4、IL-13、JAK/STAT信号通路、TMEM16A 表达、ICC、胃肠道平滑肌的运动、上下游之间的相互影响和作用途径值得进一步深入探讨。

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The roles of IL-4 and IL-13 in the damage of interstitial cells of Cajal in model rats treated with chronic and comprehensive stress

DENG Qin，CHEN Mingkai，ZHANG Li，LUO Hesheng
Department of Gastroenterology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China

ObjectiveTo observe the expression of IL-4 and IL-13 in rats treated with chronic and comprehensive stress and explore their roles in the damage of interstitial cells of Cajal.MethodsTwenty male SD rats were randomly divided into 2 groups:the model group(n=10)and the control group(n=10).Rats in model group were treated with chronic and comprehensive stress.Open-field test was used to confirm the accomplishment of model.The serum concentration of IL-4 and IL-13 were determined by ELISA and the expression of TMEM16A in the myenteric plexus was detected by immunofluorescence.ResultsThe mean serum concentration of IL-4 in the model group(8.09 pg/mL ±0.92 pg/mL)was significantly higher than that in the control group(6.98 pg/mL ±0.69 pg/mL)(t=3.363，P ＜ 0.01)，while the mean serum concentration of IL-13 in the model group(5.96 pg/mL ±0.67 pg/mL)was also significantly higher than that in the control group(5.26 pg/mL ± 0.73)pg/mL(t=2.322，P ＜ 0.05).Positive expression of TMEM16A in the myenteric plexus was observed under the fluorescence microscope.Compared with the control group，the expression of TMEM16A in the model group were decreased in all sections of the intestine.ConclusionIn model rats treated with chronic and comprehensive stress，the expression of Th2-related cytokines(IL-4 and IL-13)were increased，and it might result in the damage of interstitial cells of Cajal by affecting the expression of TMEM16A.

IL-4;IL-13;Chronic and comprehensive stress;TMEM16A;ICC

R574

A

1006－5709(2012)08－0750－04

2012-03-18

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.019

国家自然科学基金(81170350);湖北省自然科学基金(2009CDB283);武汉大学自主科研基金(3082018)

陈明锴，教授，硕士生导师。E-mail:kaimingchen@163.com