重组人p53腺病毒感染对携带不同p53状态胃癌细胞增殖和凋亡的影响

刘明月，王晚萍，周 云

1.河南省人民医院肿瘤科，河南郑州 450003;2.山西省长治市人民医院

重组人p53腺病毒感染对携带不同p53状态胃癌细胞增殖和凋亡的影响

刘明月1，王晚萍2，周 云1

1.河南省人民医院肿瘤科，河南郑州 450003;2.山西省长治市人民医院

目的 研究重组人p53腺病毒感染不同p53状态胃癌细胞对其p53蛋白表达、生长抑制率、细胞周期与凋亡率的影响。方法 不同浓度重组人p53腺病毒感染3种不同p53状态胃癌细胞，即含野生型p53基因的细胞(wild-type)、含突变型p53基因的细胞(mutant-type)、含空载质粒即p53基因缺失的细胞(vector-cell)。48 h后，用Western blotting法检测p53蛋白在3种胃癌细胞中的表达;用MTT法测定重组人p53腺病毒感染3种胃癌细胞的生长抑制率，用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。结果

rAd-p53感染3种胃癌细胞48 h后p53蛋白表达阳性，对照组p53基因缺失的胃癌细胞无表达，对照组含野生型p53基因的细胞和含突变型p53基因的细胞弱表达。rAd-p53对3种胃癌细胞的生长抑制效应在一定的浓度范围内呈剂量依赖性，而与细胞内在的p53状态无关。含野生型p53基因的细胞、含突变型p53基因的细胞和p53基因缺失的细胞感染rAd-p53后诱导G2/M期阻滞与细胞凋亡率分别增加2.5、3.6、3.2倍。结论 腺病毒介导p53基因感染3种不同p53状态胃癌细胞改变细胞内在的p53状态，p53蛋白表达、生长抑制率、细胞周期分布、凋亡率均与细胞内在的p53状态无关。

胃癌;重组人p53腺病毒;基因治疗

p53是一种抑癌基因，控制着与肿瘤发生、发展相关的多种基因的表达。正常状态下p53基因为野生型，能维持细胞正常生长，抑制恶性增殖，当其发生突变或缺失，则不但丧失了正常p53基因的功能，而且获得癌基因的功能，使得衰老细胞、异常细胞不能按正常程序死亡而不断地增殖，导致肿瘤的发生。包括胃癌在内的50%以上的肿瘤存在p53突变。随着研究的深入，针对p53基因的治疗开始成为抗肿瘤治疗的一种手段。本研究以重组人p53腺病毒感染3种不同p53状态人胃癌细胞系BGC-823，观察对其增殖和凋亡的影响，为重组人p53腺病毒在抗胃癌治疗过程中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 含3种不同p53状态人胃癌细胞系BGC-823:即含野生型p53基因的细胞(BGC-823-wild-type p53)、含突变型p53基因的细胞(BGC-823-mutant-type p53)、含空载质粒即p53基因缺失的细胞(BGC-823-vector-cell p53)(购自北京肿瘤防治研究所)。重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53)，深圳赛百诺基因技术有限公司产品。p53单抗(鼠抗人IgG，美国Santa Cruz)、免疫组化二抗(美国Santa Cruz)、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)、酶标仪(美国Stat Fax-2100)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:3种胃癌细胞 BGC-823在含有10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养液中生长，并置于37℃、5%CO2的饱和湿度条件下常规培养。

1.2.2 实验分组:依据预实验结果单药药物浓度选取4个浓度组，药物浓度的选取参考常规用药时血药峰值浓度而定。具体浓度如下:rAd-p53(vp/mL)5×106、5 ×107、5 ×108、5 ×109，实验组:含细胞，加入用培养液稀释的不同浓度的药物，每浓度组重复6～8孔。对照组:含细胞，只加等体积的培养液。

1.2.3 Western blotting法检测 p53蛋白在 p53野生型、含突变型和缺失型胃癌细胞中的表达:用蛋白裂解液提取5×107vp/mL rAd-p53 1 mL感染48 h后的p53野生型、含突变型和缺失型胃癌细胞以及对照组3种细胞的总蛋白，考马斯亮蓝标准曲线法测蛋白浓度，加入2×buffer混匀后沸水浴上煮沸5 min，冷却，－20℃保存备用。取75～100 μg蛋白在10%SDS-PAGE胶上电泳，然后转膜、杂交，一抗为鼠抗人p53蛋白单克隆抗体。

1.2.4 MTT法检测rAd-p53感染对p53野生型、含突变型和缺失型胃癌细胞的生长抑制率:细胞接种于96孔板，设对照组、4种浓度rAd-p53组，每孔加入MTT液20 μL，37℃ CO2培养箱培养4 h，弃培养液，各孔加200 μL二甲基亚砜，振荡10 min，用酶联仪在570 nm波长下检测每孔的吸光值(OD)，相同药物设计组重复3～5板，按下列公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率(%)=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.2.5 流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡:根据MTT结果选取rAd-p53浓度5×107vp/mL行流式细胞分析。p53野生型、含突变型和缺失型胃癌细胞经rAd-p53感染48 h后收获细胞，行流式细胞仪分析细胞周期分布与凋亡率。

1.3 统计学处理 实验结果以均值±标准差(x－±s)表示;方差分析、均数间的两两比较采用LSD法;单样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义;利用SPSS 10.0软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 Western blotting观察外源p53基因表达 5×107vp/mL rAd-p53感染3种胃癌细胞48 h后在53 KD位置上均有一条清晰的杂交带，对照组不加rAdp53的p53缺失型胃癌细胞在同一位置无杂交带，而对照组p53野生型和突变型胃癌细胞则在53 KD处有很浅的一条杂交带(见图1)。

图1 p53蛋白在3种细胞株中的Western blotting结果 1:含野生型p53基因的细胞;2:含突变型p53基因的细胞;3:含空载质粒的细胞;4:rAd-p53感染后的含野生型p53基因细胞;5.rAd-p53感染后的含突变型p53基因细胞;6:rAd-p53感染后的空质粒p53基因细胞.Fig 1 Western blotting analysis of P53 protein expression in gastric cancer cells with three different p53 expression status 1:BGC-823 cells with wild type p53 gene control;2:BGC-823 cells with mutant p53 gene control;3:BGC-823 cells with p53 gene deletion control;4:BGC-823 cells with wild type p53 gene+rAd-p53;5:BGC-823 cells with mutant p53 gene+rAdp-53;6:BGC-823 cells with p53 gene deletion+rAd-p53

2.2 MTT法检测rAd-p53感染3种胃癌细胞48 h后的生长抑制率 不同浓度的rAd-p53作用48 h后，3种胃癌细胞生长均受到不同程度的抑制，所有实验组与对照组间及不同浓度实验组之间OD值比较差异有统计学意义(P＜0.01)。rAd-p53感染3种不同p53状态的BGC-823细胞，同浓度组3种细胞OD值比较差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

2.3 流式细胞仪检测rAd-p53感染3种胃癌细胞的细胞周期变化与凋亡效应 p53野生型、突变型和缺失型胃癌细胞感染rAd-p53后诱导G2/M期阻滞与细胞凋亡出现Sub-G1峰;经细胞流式图分析知，各周期变化与对照组比较差异均有显著性。rAd-p53感染48 h后:对于p53野生型细胞，与空白对照组比，凋亡率增加2.6倍;对于p53突变型细胞，凋亡率增加3.5倍;对于p53缺失型细胞，凋亡率增加3.2倍;rAd-p53感染3种细胞48 h后均表现出G2/M期的强力阻断作用(见表2)。

3 讨论

p53基因是一种对于DNA损伤作出应答反应的“看家基因”，在肿瘤细胞内存在的受损DNA是p53基因表达的重要激活因素［1］。rAd-p53是携带有外源p53基因的腺病毒载体，可引起肿瘤细胞程序性死亡，而对正常细胞无损伤。rAd-p53对细胞只发生一次性感染，导入的p53可以表达生成p53蛋白质，发挥生物学效应。rAd-p53感染3种胃癌细胞后12 h，p53蛋白在核内有表达，36 h呈强阳性表达，48 h表达最强，到第5天则已为弱阳性表达，第6天接近对照组［2］。重组p53腺病毒与氟尿嘧啶联合，有协同抗结肠癌作用［3］。可以增强胃癌细胞对于化疗的敏感性［4］。

表1 不同浓度rAd-p53作用p53野生型、突变型和缺失型胃癌细胞生长抑制率比较(±s)Tab 1 Comparison of proliferation inhibition of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion in different levels of recombinant adenovirus p53(x－±s)

表1 不同浓度rAd-p53作用p53野生型、突变型和缺失型胃癌细胞生长抑制率比较(±s)Tab 1 Comparison of proliferation inhibition of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion in different levels of recombinant adenovirus p53(x－±s)

组别 例数 BGC-823-wild-type p53 BGC-823-mutant-type p53 BGC-823-vector cell p53F P对照组32 1.21 ±0.12 1.22 ±0.11 1.20 ±0.02 0.63 ＞0.05剂量 1 32 1.01 ±0.08 0.98 ±0.05 0.98 ±0.09 0.41 ＞0.05剂量 2 32 0.92 ±0.06 0.91 ±0.05 0.91 ±0.04 0.23 ＞0.05剂量 3 32 0.86 ±0.05 0.85 ±0.04 0.85 ±0.11 0.21 ＞0.05剂量 4 32 0.79 ±0.09 0.78 ±0.05 0.78 ±0.11 0.16 ＞0.05 F＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 11.02 55.31 55.65 P

表2 rAd-p53感染p53野生型、突变型和缺失型胃癌细胞的细胞周期及凋亡率比较 (±s)Tab 2 Comparison of cell cycle and apoptosis rates of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion transfected with recombinant adenovirus p53(x－±s)

表2 rAd-p53感染p53野生型、突变型和缺失型胃癌细胞的细胞周期及凋亡率比较 (±s)Tab 2 Comparison of cell cycle and apoptosis rates of BGC-823 cells with wild type，mutant p53 gene and p53 gene deletion transfected with recombinant adenovirus p53(x－±s)

p53野生型、突变型、缺失型细胞组与对照组G2/M比较，★F=652.35★P＜0.001;Sub-G1比较，★F=531.04★P＜0.001

细胞系 G1(%) S(%) G2/M(%)★ Sub-G1(%)★对照52.80 ±0.51 28.70 ±0.40 18.50 ±0.43 2.59 ±0.14 BGC-823-wild-type p53 39.60 ±0.32 14.60 ±0.51 45.70 ±0.60 9.33 ±1.27 BGC-823-mutant-type p53 38.40 ±0.64 15.80 ±0.69 45.80 ±0.79 11.76 ±2.33 BGC-823-vector cell p53 39.80 ±0.78 17.30 ±0.64 42.90 ±1.23 10.97 ±1.50

本研究在不同浓度的rAd-p53作用下，3种胃癌细胞对p53的表达明显增加，生长受到不同程度的抑制，rAd-p53对3种细胞的生长抑制呈剂量依赖性;在相同浓度下rAd-p53对3种细胞的生长抑制作用无显著性差异(P＞0.05)。这说明，rAd-p53通过表达p53蛋白来抑制肿瘤细胞生长，这种作用与rAd-p53的感染剂量相关，与胃癌细胞内在的p53状态无关。研究显示，rAd-53感染肿瘤细胞可抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡，而与肿瘤细胞内在的p53状态无关［5］。这为rAd-p53更广泛的用于临床各种肿瘤的治疗提供了可靠的实验依据。

作为重要的肿瘤抑制基因，p53在凋亡的诱导中发挥着重要作用，其激活凋亡途径主要有:一是依赖序列特异性反式激活途径，诱导表达p53下游的凋亡相关基因 p21、mdm2、GADD45等;二是与涉及 DNA合成、修复及凋亡的蛋白结合，调节凋亡的发生。p53可引起G0/G1期和G2/M期阻滞［6-7］，且G2/M阻滞的细胞更易导致凋亡。

本研究中，rAd-p53感染3种细胞48 h后:野生型细胞与其对照组比:出现G2/M期明显阻滞，凋亡率增加2.2倍;突变型细胞与其对照相比G2/M期凋亡率增加3.2倍;p53缺失型细胞与其对照组相比，G2/M期阻滞，凋亡率增加3.2倍;rAd-p53感染3种细胞48 h后均表现出G2/M期的强力阻断作用，提示rAdp53诱导的凋亡可能是通过G2/M期的阻滞来实现的，细胞周期的阻断可能是细胞凋亡的重要前提。

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The effect of recombinant adenovirus p53 transfection on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells with different types of p53

LIU Mingyue1，WANG Wanping2，ZHOU Yun1
1.Department of Oncology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003;2.Shanxi Changzhi People’s Hospital，China

ObjectiveTo Study the effect of recombinant adenovirus p53 transfection on protein expression，growth inhibition rate，cell cycles and apotosis rate cells with different types of p53.Methodsthe recombinant adenovivus p53 in different and apotosis concentrations were infected.BGC-823 with three different p53 status:BGC-823 cells with wild-type p53 gene，BGC-823 cells with mutant type p53 gene and BGC-823 cells with p53 gene deletion were transfected with recombinant human p53 adenovirus.After 48 h，the expression of p53 protein in three gastric cancer cell lines was detected by Western blotting method;cell proliferation was determined by MTT，cell-cycle distributions and apoptosis rates were detected by Flow Cytometry.ResultsThree types of gastric cancer cells transfected with rAd-p53 expressed p53 protein.However，in the control groups，cells with wild type p53 and cells with mutant p53 express P53 weakly，cells with p53 gene deletion did not express p53 protein.Proliferation of three gastric cancer cell lines were rAd-p53 dose-dependent，regardless of the cell-endogenous p53 status.Induced G2/M phase arrests and apoptosis rates of cells with wild type p53，cells with mutant p53 and cells with p53 gene deletion transfected with rAd-p53 increased 2.5，3.6，3.2 times than controll groups，individually.ConclusionTransfected with adenovirus-mediated p53 gene，three different p53 types gastric cancer cells changed the p53 status.P53 protein expression，growth inhibitions rate，apoptosis rates and cell cycles were independent with cell-endogenous p53.

Gastric cancer;Recombinant adenovirus p53;Gene therapy

R735.2

A

1006－5709(2012)08－0740－03

2012-07-10

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.016

王晚萍，主治医师，研究方向:呼吸道肿瘤的综合治疗。

E-mail:wanping1124@163.com