尼莫地平对兔早期脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

张国臣 吴新建 郭少雷 张弩 张恒 齐铁伟

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemicreperfusion injury，SCII)是指所有导致脊髓缺血性损伤的因素去除后，脊髓恢复血供，神经功能障碍没有得到应有的改善，反而在原缺血性损伤的基础上进一步加重，甚至在病理上出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象[1-2]，属于原发性脊髓损伤的继发性损害。临床上常见于脊髓内显微外科手术、各种类型脊髓损伤、胸腹主动脉手术等。国内外文献报道尼莫地平对SCII是否有保护作用仍有异议[3-6]，而我们在临床工作中发现尼莫地平对SCII有一定治疗效果，故设计本实验探讨尼莫地平对SCII的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 成年新西兰大白兔18只，雌雄不限，体质量(2.5±0.5)kg，购于广东省实验动物中心。尼莫地平注射液购自德国拜耳公司。

1.2 SCII模型的建立及分组 参照文献建立缺血再灌注模型[7-9]：实验动物术前禁食约12 h。速眠新Ⅱ(0.2 mL／kg)肌肉注射加3%戊巴比妥(1 mL／kg)静脉注射复合麻醉。然后将兔全身肝素化(200 U／kg)，取腹部正中偏左约1.5 cm纵向手术切口开腹，充分显露腹主动脉，游离左侧肾动脉至双侧髂总动脉分叉处之腹主动脉，轻轻翻转腹主动脉，辨认腹主动脉背侧发出的腰动脉。自上向下分别为下 L1、下 L2、下 L3、下 L4、下 L5 动脉[9]，取四个动脉瘤夹分别夹闭下L1、下L2、下L3、下 L4动脉后计时，90 min后逐一取下动脉瘤夹使腰动脉再灌注，逐层关腹。研究对象随机分为3组：假手术组、对照组、尼莫地平组，每组6只，置于相同环境饲养，每笼1只。其中尼莫地平组：开腹后行目标腰动脉夹闭90 min，术后1 h开始静脉注射尼莫地平注射液0.17 mg／(kg·次)+生理盐水(稀释为 10 mL，每 8 h一次，每次注射 15 min)；假手术组：开腹后行目标腰动脉暴露90 min，术后1h同方法同频率注射同体积生理盐水；对照组：开腹后行目标腰动脉夹闭90 min，术后1h同方法同频率注射同体积生理盐水。

1.3 Reuter 评 分 Reuter 感觉运动评分[10]标准：①牵张反射(0正常，1轻微反射亢进或减弱，2反射亢进或消失)；②疼痛回缩反射(0灵活的，1缓慢笨拙的，2消失)；③背部感觉(0完全正常，1部分正常，2消失的)；④肌张力(0正常，1张力减退或亢进，2张力消失或痉挛状态)；⑤后肢运动能力(0可行走，1仅能站立，2可自由活动后肢，3不能活动后肢)。每8 h静脉注射药物前评定一次，每次各研究对象评定2 min。各组各个时间点的Reuter评分为5项评分的总和。

1.4 动物标本摘取、染色及观察 3 d后速眠新Ⅱ加3%戊巴比妥复合麻醉，仰卧位固定，开胸暴露心脏，经主动脉弓先后灌注磷酸盐缓冲液和40 g／L 的多聚甲醛各 1000～1500 mL[7]，再将兔俯卧位固定，背部正中切开，分离椎旁肌肉，剪除L4～L7棘突和椎板，暴露硬脊膜，纵向切开，截取腰段脊髓组织(L5～L7)放入10%福尔马林溶液内固定2～5 d。所取标本均行常规苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、甲苯胺蓝尼氏染色法(tolridine blue Nissl staining)和免疫组织化学染色链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase，SP)法。染色成功后按照Rexed脊髓灰质分区标准[11]取脊髓前角视野(8～9区)观察，比较三组之间脊髓灰质前角整体细胞结构、正常尼氏小体数量、免疫组化表达程度等。染色指数(staining index，SI)作为免疫组化半定量评价指标，SI＝染色区域比例×染色强度，染色区域比例计分：根据染色区域占观察区域的百分率分为四级，1级(≤25%)、2级(＞25%，≤50%)、3 级(＞50%，≤75%)、4 级(＞75%)，分别记1～4分。染色强度计分：按染色深浅分四级，1级(无染色)、2 级(弱阳性，呈浅黄色)、3 级(中等阳性，呈棕黄色)、4级(强阳性，呈棕色)，分别记 1～4分。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 19.0处理数据。Reuter评分资料、尼氏小体计数资料和染色指数资料用[M(QL，QU)]表示，采用 Wilcoxon 秩和检验两两比较并用Bonferroni法调整检验水准为α′α＝ 0.05，α′＝ 0.05／3 ＝ 0.017。

2 结果

2.1 Reuter感觉运动评分 表1显示假手术组和对照组、假手术组和尼莫地平组之间有明显差异；对照组和尼莫地平组之间在第1 d、第2 d时差异无明显统计学意义(T1d＝36.00，P1d＝0.61＞0.017；T2d＝33.50，P2d＝0.29＞0.017)。 而在第 3 d时差异有明显统计学意义(T3d＝25.00，P3d＝0.01＜0.017)。

表1 Reuter感觉运动功能评分M(QL，QU)

2.2 脊髓组织病理学观察 HE染色可见假手术组脊髓灰质前角整体结构清晰、完整，可见较大的轮廓清晰、结构正常的运动神经元，未见明显炎症细胞浸润、出血、水肿、空泡样变化等异常(图1A)；对照组脊髓灰质前角结构紊乱，可见局部中重度水肿、空泡样变，神经元及胶质细胞损伤较重，未见结构明显的正常运动神经元(图1B)；尼莫地平组脊髓灰质前角结构紊乱较对照组轻，局部轻中度水肿、空泡样变，可见明显红色神经元的存在(图 1C)。

尼氏染色可见假手术组脊髓灰质前角内尼氏小体结构清楚，胞浆内所见嗜碱性颗粒分布均匀，数量较多(图2A)；对照组未见正常尼氏小体结构，仅见少量中央性尼氏小体溶解后残留的嗜碱性颗粒(图2B)；尼莫地平组可见少量正常结构尼氏小体，且可见胞质中央尼氏小体溶解尚未消失的嗜碱性颗粒聚集(图2C)。各组尼氏小体计数结果见表2，三组之间，两两比较差异均有统计学意义(T＝21.00，P＜0.017)。

神经胶质原纤维酸性蛋白的表达，假手术组未见脊髓前角明显条索状、棕黄色颗粒表达(图3A)；对照组见大量条索状、棕色颗粒样GFAP表达，表达面积较广，染色较重(图3B)；尼莫地平组亦可见类似的棕黄色颗粒，但较对照组表达面积小，染色程度较轻(图3C)。各组染色指数结果见表3，三组之间两两比较差异均有统计学意义(T＝21.00，P ＝ 0.002 ＜ 0.017)。

图1 脊髓灰质前角HE染色(×200)。

图2 脊髓灰质前角尼氏染色(×200)。

表2 脊髓灰质前角尼氏小体计数

图3 脊髓灰质前角GFAP染色(×200)。

表3 脊髓灰质前角GFAP染色指数

3 讨论

本实验研究对象脊髓供血动脉比较单一，且相互间缺少充分的吻合支，尤其是腰段脊髓，以腰动脉供血为主，为夹闭腰动脉建立模型提供了理论基础。研究对象体积较大，血管易于分离，可单纯夹闭腰动脉，能避免夹闭腹主动脉后双下肢缺血对实验结果的影响，使误差更小。模型建立后行为学和病理学方面的差异较为稳定，提示模型建立成功，所选研究对象满足实验条件。

SCII是一个复杂的、多种因素共同参与的病理生理学过程，其中细胞内Ca2+超载是引起神经损伤的重要一环，理论上抑制Ca2+内流可减轻神经损伤程度。尼莫地平是经典的第二代钙离子通道阻滞剂之一，可作用于与钙离子通道有关的血管受体[12]和神经元受体[13]，明显降低细胞内钙离子水平，达到抗血管痉挛和抗缺血作用，提高神经元的缺血耐受能力和功能的稳定性。

本实验中，从表1可以看出，各观察时间点假手术组和对照组、假手术组和尼莫地平组之间差异明显。3 d时尼莫地平组Reuter评分较对照组低，差异有统计学意义，1 d、2 d时两组差异无统计学意义，我们考虑原因为SCII最初阶段再灌注损伤尚未达到一定程度，而随着再灌注损伤的加重，尼莫地平对脊髓的保护作用才得以体现。图1表明在治疗3 d后，尼莫地平组脊髓灰质前角的整体结构紊乱、水肿、空泡样变等损伤较对照组轻，且可见大量红色神经元。红色神经元是神经元损伤后处于早期阶段的一种标志。因此，我们认为尼莫地平可能通过延缓SCII带来的一系列序贯性损伤，使损伤维持在较早阶段甚至可逆阶段。图2表明，尼莫地平组尼氏小体数量、结构均较对照组好转，这是因为表示运动神经元功能活性的尼氏小体在发生中央性尼氏小体溶解的早期，病变过程是可逆的，具有代偿意义，而给予的适当的尼莫地平干预措施使得部分损伤早期的尼氏小体基本恢复正常。尼氏小体计数之间的差异也表明治疗有效(表2)。 星形胶质细胞(astrocyte，Ast)在神经系统疾病的病理生理过程及神经瘢痕修复中起重要作用。作为公认的Ast的特征性标记蛋白[14]，神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达能反映出神经细胞损伤程度，且两者呈反比关系，即神经细胞损伤越重，GFAP表达量越多。如图3所示，假手术组拟定区域未见明显GFAP表达，脊髓无明显损伤；尼莫地平组和对照组均见明显GFAP表达，且尼莫地平组表达产物面积及染色程度较对照组低，间接证明尼莫地平组脊髓损伤较对照组轻，说明尼莫地平的治疗减轻了脊髓损伤程度。

总之，通过本研究发现，尼莫地平作为经典的钙离子通道阻滞剂，可以在神经行为学和组织病理学方面有效地降低脊髓缺血再灌注所带来的一系列序贯性损伤，有一定的保护作用，但其临床疗效仍需在严密设计下进行临床研究予以证实。

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