磷酸二酯酶4D基因SNP83位点与新疆维吾尔族、汉族缺血性脑血管疾病的相关性☆

马建华 裴静 张小宁

缺血性脑血管病(ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是一类多基因疾病，其发生与个体遗传易患性和环境因素的相互因素有关[1]。其中磷酸二酯酶 4D基因(phosphodiesterase 4D，PDE4D)与ICVD有一定关联[2]。新疆是多民族聚居区，维吾尔族和汉族是新疆的主要民族，约占新疆人口的85%。新疆维吾尔族持有自己相对独特的生活方式，人口流动性小，遗传背景及生活方式较一致，是遗传学研究的很好自然人群。其与汉族不同的遗传背景可能存在遗传易感基因的差异性。我们对新疆地区的维吾尔族、汉族ICVD患者和正常人的PDE4D基因分型进行检测，主要为了分析新疆维吾尔族和汉族ICVD患者PDE4D基因SNP83位点基因型及等位基因频率的分布以及两个不同民族之间是否存在差异性，进一步探讨PDE4D基因SNP83位点多态性与新疆地区不同民族ICVD患者发病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 新疆医科大学第一附属医院、喀什地区第二人民医院、阿克苏地区第一人民医院的神经内科自2007年12月至2009年12月入院的ICVD患者，对照组为同期健康体检者和在上述三所医院外科系统住院治疗的其他无脑梗死疾病患者。所有入选者均为长期生活在新疆地区的维吾尔族和汉族人。

1.1.1 病例组 入选标准：符合“第四届脑血管病会议的脑血管疾病诊断要点”所制定的诊断标准[3]，经头部CT检查除外脑出血。排除标准：无症状及体征的静止性脑梗死，包括TIA，拒绝参与登记调查。

1.1.2 对照组 入选标准：为同期健康体检者和在上述三所医院外科系统住院治疗的其他无脑梗死疾病患者。排除标准：既往卒中或TIA史，有过颅内外动脉狭窄血管成形术者；发病时有严重的心脏病、心功能不全、肝功能障碍、肾功能不全、呼吸衰竭、恶性肿瘤等；精神病患者；服用抗凝、抗血小板药物者；自身免疫性疾病；血液系统疾病；6个月内外伤手术史、3个月内感染性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每例对象抽取静脉血 2 mL，EDTA抗凝，-70℃冻存。用北京百泰克中量全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 PDE4D基因 SNP83位点的 PCR扩增 采用PCR扩增PDE4D基因SNP83位点，引物按参考文献[4]设计，由上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物序列5′-GATTTATGTCTTATACTTTC-3′； 下游引物序列 5′-TGCTTTTTGAAGATGCATACTTTGT-3′。该序列所扩增产物为368 bp，中间包括一个对应于内切酶TaiI酶切位点，由此形成限制性片段长度多态性。PCR反应体系：总体积为25 μL，包括 Mix 12.5 μL(含有 3 mmol／L Mg Cl2、0.5 mmol／L dNTP、和 2× PCR 缓冲液)，上下游引物各 0.5 μL，基因组 DNA 2.0 μL，去离子水 9.5 μL。PCR扩展循环参数：94℃预变性5 min；反应循环：94℃变性 30 s；52℃ 退火 30 s；35 个循环后；最后72℃继续延伸10 min后降至4℃终止。

1.2.3 PCR产物的内切酶消化 检测 PDE4D基因 SNP83位点扩增产物后，PCR 产物 10 μL，10×buffer R 2 μL，TaiI 10 U，灭菌去离子水补充体积至31 μL，置65℃恒温水浴箱内消化过夜。酶切产物经5%琼脂糖凝胶电泳，70 V电压，凝胶电泳分离后。EB染色并于紫外灯下观察，凝胶成像系统(Unvitec，BTS-20M)照相、分型。

1.2.4 统计学方法 数据分析采用 SPSS 13.0软件包进行处理。应用等位基因频率＝等位基因阳性数／总基因数(患者数 ×2)，计算出病例组和对照组PDE4D基因SNP83位点基因型频率和等位基因频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律做吻合度检验。计量资料的比较先行正态性检验和方差齐性检验，符合条件者采用t检验，方差不齐者采用秩和检验；应用χ2检验比较两组PDE4D基因SNP83位点基因型和等位基因频率分布，通过计算比值比(odds ratio，OR) 对 ICVD与 PDE4D基因SNP83各等位基因进行关联分析并检验。检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 一般资料 ①病例组：入院207例缺血性脑血管病患者，其中维吾尔族109例、汉族98例，男女比例为151∶92，年龄范围 22～85岁，平均年龄为(58.70±8.10)岁；② 对照组共入选 216名，其中维吾尔族110名、汉族106名，男女比例为119∶97，年龄范围20～85岁，平均年龄为(56.87±9.70)岁。

2.2 PDE4D基因 SNP83位点多态性检测 以TaiI酶切PCR产物时，突变纯合子(T／T基因型)不能被切开，酶切后仅见与PCR扩增产物一样的368 bp片段；野生型(C／C基因型)全部能被TaiI酶切割，酶切后可见216 bp及152 bp两个片段；突变杂合子(C／T基因型)中，只有C等位基因被TaiI酶切割，酶切后可见368 bp、216 bp、152 bp 3个片段。见图1。

图1 1：DL2000 marker； 2、6：T ／T；3、7：C ／C； 4、8：C ／T

2.3 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验 病例组与对照组基因型的观察值和期望值均符合Hardy-Weinberg的平衡法则，吻合度检验良好(病例组χ2＝0.616，df＝2，P＞0.05；对照组χ2＝3.163，df＝ 2，P ＞ 0.05)。

2.4 PDE4D基因型和等位基因频率分布 从表1可见，病例组CC基因型及C等位基因增多，TT基因型减少，病例组与对照组间PDE4D基因的C／C基因型、T／T基因型及C等位基因分布的差异具有统计学意义(P＜0.05)，携带C等位基因个体发生ICVD的危险性高于携带T等位基因个体，其OR 值为 4.023(95%CI：1.308～12.368，P ＜ 0.05)。

2.5 新疆维、汉两民族PDE4D基因型和等位基因频率分布 表2可见维、汉两民族PDE4D基因SNP83位点基因型分布均以C／C型为主，且维、汉两民族之间PDE4D基因SNP83位点基因型和等位基因频率的分布差异有统计学意义(P＜0.05)。在同一民族中，维族ICVD组与对照组间PDE4D基因SNP83位点各基因型和等位基因频率的分布差异无统计学意义(P＞0.05)，而在汉族ICVD组与对照组间基因型和等位基因频率分布差异有统计学意义(P＜0.05)，且在汉族携带C等位基因个体发生ICVD的危险性高于携带T等位基因个体，其OR 值为 2.679(95%CI：1.471～4.880，P ＜ 0.05)。

2.6 不同性别PDE4D基因型和等位基因频率分布的比较 从表3可见，在女性ICVD组与女性对照组PDE4D基因SNP83位点基因型频率和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。在男性ICVD组与男性对照组间PDE4D基因SNP83位点的基因型频率和等位基因频率的分布差异有统计学意义(χ2＝ 7.577，P ＜ 0.05)，且 C／C 基因型频率分布在ICVD组与对照组间差异有统计学意义(χ2＝4.246，P＜0.05)，并发现携带 C 等位基因的男性个体发生ICVD的危险性显著增加，其OR值为6.486。

表1 病例组与对照组PDE4D基因型和等位基因频率分布

表2 新疆维吾尔族、汉族PDE4D基因型和等位基因频率分布

表3 不同性别PDE4D基因型和等位基因频率分布

3 讨论

2003 年，Gretarsdottir等[2]卒中基因解码科学小组人员在冰岛人群中首次发现了与家族性缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular diseases，ICVD)相关的基因：磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)基因与脑动脉粥样硬化的发生、发展有关。该基因和以往认识的与高血压、糖尿病、血脂代谢异常等脑血管病危险因素的相关基因不同，被认为是21世纪首先、也是迄今唯一新发现的卒中候选基因[5]。

本研究首次报告了新疆地区维吾尔族和汉族ICVD中PDE4D基因存在SNP83位点多态性。结果显示在ICVD组和对照组中均以C／C基因型频率最高，携带C等位基因个体发生ICVD的危险性高于携带T等位基因个体，其OR值为4.023(95%CI：1.308～12.368，P ＜ 0.05)。 这与上述国内外报道的结果基本一致。但目前也有一些相反的报道。如日本最近[6]一项研究经多重比较校正后，并未发现该位点与ICVD有相关性。荷兰[7]对一个地理相对封闭的人群进行SNP83及它们衍生的单倍型进行检测，与ICVD无相关性。导致这种情况的可能原因是：①在不同种族人群中PDE4D基因SNP83的基因型和等位基因频率分布存在差异；②对ICVD的纳入标准存在差别；③分析的ICVD例数较少。故认为携带C等位基因个体发生ICVD的危险性高于携带T等位基因个体尚有大量的研究得以证实。

在我们的研究显示：在同一民族中，在汉族ICVD组与对照组间基因型和等位基因频率分布差异有统计学意义，且在汉族携带C等位基因个体发生ICVD的危险性高于携带T等位基因个体，其OR 值为 2.679(95%CI：1.471～4.880，P ＜ 0.05)。而在维吾尔族中未发现PDE4D基因SNP83多态性与维族ICVD的发病有关联。在不同种族人群中PDE4D基因多态性的研究结果并不一致。美国对以高加索人为主的人群为研究对象[8]，结果发现与SNP83位点与大动脉硬化性脑梗死有明显的相关性。与美国学者 SongQ[9]和巴基斯坦学者SaleheenD 等[10]以得出了一致的结论。 Banerjee 等[11]以印度人群为主的人群为研究对象，结果表明PDE4D基因SNP83位点C／C等位基因型和ICVD明显相关。导致这一结果的原因如下：①种族之间遗传因素存在差异；②新疆地区维吾尔族人群中可能存在有其他未知的生活习惯和环境因素对ICVD的发病的影响。因此还需大量研究加以证实。

本研究结果显示：男性ICVD组与男性对照组间PDE4D基因SNP83位点的基因型频率和等位基因频率的分布差异有统计学意义，且C／C基因型频率分布在ICVD与对照组间差异有统计学意义，并发现携带C等位基因的男性个体发生ICVD的危险性显著增加。提示在维、汉两民族男性ICVD患者的发病与PDE4D基因SNP83多态性存在关联。我国曹军[12]等发现男性发生ICVD高于女性的30%。目前认为男性患病率高可能与男性体内激素变化特点和接触危险因素(吸烟、饮酒等)相对女性要多些有关。此外，两性ICVD发病有不同遗传背景和遗传因素，还需大量的研究进一步证实不同遗传因素与PDE4D基因SNP83多态性之间是否存在关联。

综上所述，本研究就新疆地区维吾尔族和汉族在ICVD患者PDE4D基因83位点的多态性进行分析，探讨了其与ICVD的关系。发病上可能有不同的遗传易感因素，但对PDE4D基因SNP83与ICVD的确切关系以及它是如何与其它致病基因相互作用引发ICVD的，仍有待进一步研究。

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