桦褐孔菌的不同提取物对胃癌BGC－823细胞株生长抑制作用的体外观察

崔 涛 钟秀宏 杨淑艳 赵丽微 关晓辉 (北华大学附属医院消化内科，吉林 吉林 320)

桦褐孔菌属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，学名:Fuscoporia obliqua(Pers.Fr.)Aoshi或 Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，俄语名为:Chaga〔1〕。16 世纪至今，东欧一些国家的民间就用这种菌的菌核来防治癌症、心脏病、肝病、胃病等。近年来桦褐孔菌引起俄罗斯、北欧、日本、美国及韩国等国家的相关学者的重视，已经分离出栓菌酸、三萜类化合物、类固醇、桦褐孔菌醇等成分，有报道桦褐孔菌提取物对胃癌 MGC-803、结肠癌 SNU-484、宫颈癌 HelaS3、肺癌 A549和人类乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞的增殖有抑制作用，并促进肿瘤细胞的凋亡〔2，3〕。本研究利用MTT比色法，比较不同提取方法获得的桦褐孔菌提取物对胃癌BGC-823细胞株生长的抑制作用，为提取分离桦褐孔菌中高效抗胃癌有效单体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 桦褐孔菌水提取物由延边圣霖菌业有限公司提供，石油醚提取物(醚提取物)、乙酸乙酯提取物(酯提取物)由延边大学药学院提供。人胃癌细胞株BGC-823购自中科院上海细胞所。无支原体胎牛血清、噻唑蓝(MTT)为北京华美公司产品。RPMI 1640培养基为Gibco公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为江苏鸿声化工厂产品。胰蛋白酶(Tripsin)为Difco公司产品。

1.2 桦褐孔菌提取液的制备 取桦褐孔菌1.28 kg，粉碎，用95%乙醇回流提取，减压回收溶剂，得到醇提取物57 g。残渣进行水煎煮，煎煮液加乙醇放置产生大量沉淀，抽滤后滤液再加95%乙醇使含醇量达80%，过滤、沉淀、低温干燥后得到粗制多糖，再溶解于水进行乙醇反复醇沉，沉淀用丙酮洗涤抽滤干燥得到精制多糖。

醇提取物中加水使其充分分散后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得到石油醚萃取物3.10 g和乙酸乙酯萃取物29.40 g。乙酸乙酯萃取物反复进行常压硅胶柱层析分离，分别用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱分离，重结晶得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ;给石油醚萃取物反复进行常压硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱分离，重结晶得到化合物Ⅲ，三个化合物均属羊毛甾烷醇的三萜类化合物〔4〕。

1.3 细胞培养 细胞株生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，另加青、链霉素各100 kU/L，置于37℃ 、5%二氧化碳及饱和湿度的培养箱中培养。胃癌细胞生长旺盛，于实验前24 h半量换液，用0.4%苔盼蓝染色3 min，观察活细胞。本实验所用的细胞活性在98%以上。

1.4 实验分组及药物处理 胃癌BGC-823细胞株随机分为对照组和不同方法提取的各桦褐孔菌提取物组，即桦褐孔菌水提取物组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组，每个组又分为10、20、40、80 g/ml四个剂量组。各组分别在培养48 h时收集肿瘤细胞并观察细胞的变化。

1.5 药物毒性实验 桦褐孔菌提取物对胃癌BGC-823细胞株的细胞毒作用，采用MTT比色法，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。药物抑制率(%)=〔1－(实验组A值－对照组 A值)/对照组A值〕×100%，A值为492 nm实验波长下测定的每孔的光吸收值。

1.6 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行t检验。

2 结果

桦褐孔菌水提取物、醚提取物、酯提取物在10～80 g/ml范围内对胃癌BGC-823细胞株均有抑制作用，并表现出浓度依赖性关系。桦褐孔菌酯提取物组10、20、40、80 g/ml各作用肿瘤细胞48 h时，其抑制率分别为21%、33%、49%、62%;醚提取物组分别为17%、35%、39%、60%;水提取物组分别为20%、36%、47%、51%。80 g/ml醚提取物和酯提取物的抑制率和水提取物之间有显著性差异(P＜0.01);相同浓度醚提取物和酯提取物对人胃癌细胞BGC-823细胞株抑制作用无差异(P＞0.05)。见图1。

图1 桦褐孔菌的不同提取物作用于人胃癌BGC-823细胞株48 h的抑制

3 讨论

人们在动物实验〔5〕中发现桦褐孔菌提取物具有明显的肿瘤抑制作用。本结果以桦褐孔菌醚提取物和酯提取物的抑制率明显。桦褐孔菌水提取物主要成分有多酚化合物单宁酸、多糖及可溶性蛋白质和脂肪等。单宁酸是一种广泛分布在植物体内的多酚类化合物，具有抗诱变、抗肿瘤、抗癌的作用，对肺、皮肤、胃、结肠癌细胞有很好抑制作用〔6〕。Cui等〔7〕也发现多酚化合物具有细胞毒作用、清除自由基和很强的抗氧化作用。真菌水提取物多糖中，水溶性较高的葡聚糖的生物活性较高，β-1，3-D-葡聚糖具有抑制肿瘤生长的生物活性，真菌多糖对多种肿瘤具有抗肿瘤作用〔8〕。

He等〔9〕将桦褐孔菌醚提取物中分离出三种新的羟脂甾烷三萜类化合物，赵芬琴等〔4〕分离出 3，22 R-dihydroxy-lanosta-8，24-diene(inotodio1)，是桦褐孔菌的抗突变活性成分，Cui等〔7〕发现三萜类具有细胞毒作用、清除自由基和抗氧化作用。本实验提示醚提取物和酯提取物活性成分三萜类化合物有较强的抗肿瘤作用。

关于桦褐孔菌提取物的抗肿瘤作用机制还不十分清楚。国外学者发现桦褐孔菌的水提取物对体外的人类子宫颈肿瘤细胞HelaS3，通过影响有丝分裂指数和酶活性来抑制肿瘤细胞生长〔3，10〕。本实验室研究发现水提取物、醚提取物、酯提取物均能抑制多种肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与肿瘤细胞阻滞于细胞周期的S期〔11，12〕，和通过线粒体途径诱导胃癌细胞凋亡有关。

以上实验研究发现，桦褐孔菌3种提取物在体外均能抑制胃癌细胞株BGC-823增殖，其中醚提取物、酯提取物抑制率最高。本实验结果提示，桦褐孔菌3种提取物中，除了多糖、多酚类化合物外，通过醚和(或)酯提取法提取分离的桦褐孔菌中的三萜类单体，对进一步研究桦褐孔菌的抗肿瘤作用具有重要意义，应继续深入研究。

1 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌〔J〕.中国食用菌，2002;21(4):7-8.

2 李英秀，崔基成，孙东植，等.桦褐孔菌提取物对胃癌MGC-803细胞株的抗增殖与诱导凋亡作用〔J〕.菌物研究，2003;1(1):17-21.

3 Rzymowska J.The effect of aqueous extracts from Inonotus obliquus on the mitotic index and enzyme activities〔J〕.Boll Chim Farm，1998;137(1):13-5.

4 赵芬琴，朴惠善，韩春姬.桦褐孔菌的抗突变活性成分分析〔J〕.延边大学医学学报，2004;27(4):250-2.

5 金 光，杨恩月，金晴昊，等.桦褐孔菌多糖的抗肿瘤的作用实验研究〔J〕.延边大学医学学报，2004;27(4):257-9.

6 马志红，陆忠兵，石 碧.单宁酸的化学性质及应用〔J〕.天然产物研究与开发，2003;15(1):87-91.

7 Cui Yong，Dong-Seok Kim，Kyoung-Chan Park.Antioxidant effect of Inonotus obliquus〔J〕.J Ethnopharmacol，2005;96(1-2):79-85.

8 陈丽芳，吴文光，陈国锐.真菌多糖的抗肿瘤作用探讨〔J〕.海峡医学，2002;14(2):58.

9 He J，Feng XZ，Lu Y et al.Three new Triterpenoids from Fuscoporia obliqua〔J〕.J Asian Nat Prod Res，2001;3(1):55-61.

10 Burczy KJ，Gawron A，Slotwinska M，et al.Antimitotic activity of aqueous extracts of Inonotus obliquus〔J〕.Boll Chim Farm，1996;135(5):306-9.

11 钟秀宏，杨淑艳，孙东植，等.桦褐孔菌提取物诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡的研究〔J〕.中国药房，2007;18(34):2661-3.

12 钟秀宏，孙东植，崔基成，等.桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC-823细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用〔J〕.延边大学医学学报，2006;29(2):82-6.