白芨三萜类化合物的提取工艺优化

李荣峰，韦春财，刘彩华

（百色学院农业与食品工程学院，广西 百色 533000）

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]，又名白及，在日本岛内亦被叫做“雪如来”[1]，归属兰科白芨属植物，是一类常年不需要更新繁殖却可以继续生长的草本植物，属于稀少的名贵药材，最早被记录于秦汉时期的《神农本草经》[2]中，其药用价值较高的是长年生长于地下的根状茎，性微寒可去火，味道苦涩含甘味[3]。白芨具有医治肿胀中毒，加快新肉生长，各种出血症的止血等奇特功效，在亚洲的缅甸北部、中国以及日本等较为潮湿的地域均有分布，在中国境内的分布极为广泛，主产省区有贵州、湖南等[1]。据文献报道，目前从白芨植物中分离出来的化合物已超过90 种，主要包括菲、联苄、糖苷、类固醇、三萜和花青素苷类等[4]，其中三萜物质主要为环烷烃三萜类化合物[5]。研究表明，三萜类化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒（包括艾滋病病毒）等多种功效，在药物研发中有很高的利用价值[6-9]。目前，关于白芨三萜类化合物在防治疾病过程中对机体的作用及其原理已有相关报道，但有关白芨药材中三萜类化合物总量、提取工艺等方面的研究报道还比较少。为了更好地开发利用白芨资源，笔者通过超声波辅助乙醇提取法，用正交试验优化白芨中三萜类化合物的提取工艺，探究乙醇浓度、料液比、超声波处理温度和超声波处理时间对白芨三萜类化合物提取效果的影响，以期为三萜类化合物的后续研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为中草药白芨，购于云南省。主要试剂有熊果酸、无水乙醇、高氯酸、冰乙酸、香草醛等试剂，均为分析纯。主要仪器设备有FA11204B 电子天平（安亭电子仪器）、SHB-III 循环水式多用真空泵（郑州世纪双科实验仪器）、TD5A-WS 台式低速离心机（湖南湘仪）、KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器）、DK-98-II 电热恒温水浴锅（天津市泰斯仪器）、UV-1800 紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器）。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理取干燥的白芨根状茎，用中药材粉碎机进行粉碎，过60 目筛，清除难以粉碎的大颗粒以及肉眼可见的异物，得到白芨粉末，置于封口袋中密封保存待用。

1.2.2 白芨三萜类化合物单因素提取方法（1）乙醇体积分数。称取白芨粉末0.5 g，在料液比为1 ∶30（g ∶mL，下同）、温度40℃、超声波功率350 W 的条件下处理20 min，研究不同乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）对白芨三萜类化合物提取率的影响。（2）料液比。精准称取白芨粉末0.5 g，在乙醇体积分数为70%、温度为40℃、超声波功率350 W的条件下处理20 min，研究不同料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50）对白芨三萜类化合物提取率的影响。（3）超声波处理时间。精准称取白芨粉末0.5 g，在乙醇体积分数为70%、料液比为1 ∶40、温度为40℃、超声波功率350 W 的条件下，研究不同超声波处理时间（10、20、30、40、50 min）对白芨三萜类化合物提取率的影响。（4）超声波处理温度。精准称取白芨粉末0.5 g，在乙醇体积分数为70%、料液比为1 ∶40、超声波功率350 W 的条件下处理20 min，研究不同温度（30、40、50、60、70℃）对白芨三萜类化合物提取率的影响。

1.2.3 正交试验优化白芨三萜类化合物提取工艺经过单因素试验确定乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度4 个单因素，采用4 因素3 水平进行L9(34)正交试验设计（见表1），设置12 个处理，以优化白芨三萜类化合物最佳的提取条件。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3 项目测定

1.3.1 标准曲线的制作准确称量5.00 mg 熊果酸，用少量无水乙醇溶解，加至25 mL 的容量瓶中定容，制得浓度为0.2 mg/mL 的熊果酸标准样品溶液。精密吸量0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的熊果酸标准样品溶液（浓度为0.2 mg/mL）至容量为25 mL试管中，在95℃水浴锅中将溶剂彻底挥发，再依次加入高氯酸1 mL、5%香草醛-冰乙酸0.3 mL。放入60℃水浴锅加热反应15 min，加热结束后将其取出放置于流动的自来水中加速冷却，待其冷却后加入冰乙酸5 mL，充分震荡，静置15 min 让其发生显色反应，再用紫外分光光度计在550 nm 波长下测量吸光度。根据吸光度和标准样品浓度绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.3.2 样品的测定称量0.5 g 白芨粉末，用少量无水乙醇溶解，加至25 mL 容量瓶中定容，按照1.3.1的方法测定样品溶液在550 nm 下的吸光度值。将测得的吸光度值代入标准曲线回归方程计算三萜类化合物的质量浓度，并按以下公式计算白芨三萜类类化合物的提取率。

提取率（%）=（25C/1 000M）×100

式中：C是样品中三萜类化合物质量浓度（mg/mL）；M为称取的白芨粉末质量（g）。

1.4 数据统计与分析

所有的试验数据重复3 次取平均值，采用Microsoft Excel 2010 软件和IBM SPSS Statistics 25 软件进行数据整理、统计与分析。

2 结果与分析

2.1 白芨三萜类化合物提取的单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对白芨三萜类化合物提取率的影响 从图1 可以看到，当乙醇体积分数在50%～70%范围内时，随着乙醇体积分数的增大，三萜类化合物的提取率逐渐增加，当乙醇体积分数为70%时，白芨中三萜类化合物的提取率达到最大；当乙醇体积分数超过70%后，随着乙醇体积分数的增加，白芨三萜类化合物提取率越来越低。原因可能是因为刚开始乙醇浓度小，没能将白芨三萜类中的物质提取出来；所以根据物质极性的相似相溶原理，在浓度为70%的乙醇体积分数条件下，三萜类物质浸提出来的含量最高。因此，白芨三萜类化合物提取的最佳乙醇体积分数为70%。

图1 乙醇体积分数对白芨三萜类化合物提取率的影响

2.1.2 料液比对白芨三萜类化合物提取率的影响从图2 可以看出，随着溶剂体积的增加，白芨三萜类化合物的提取率先增加后下降，当料液比为1 ∶40 时，提取率最高，达到0.608%，继续增加溶剂的体积，提取率有所下降。因此，白芨三萜类化合物提取的最佳料液比为1 ∶40。原因可能是因为刚开始乙醇体积不多时，超声波冲击液体产生的气泡使得介质的传播速率受到限制，所以三萜类化合物提取效果不佳；而当达溶剂体积超过适宜量时，随着乙醇体积的增加，超声波无法充分发挥将声能转变为热能的作用，振动效果不佳，不利于三萜类物质的析出，同时反而有利于其他物质析出，导致三萜类化合物提取率下降。

图2 料液比对白芨三萜类化合物提取率的影响

2.1.3 超声波处理时间对白芨三萜类化合物提取率的影响 从图3 可以看出，超声波处理10～50 min 时，随着处理时间的延长，白芨三萜类化合物提取率呈先上升后下降的趋势，当超声波处理20 min 时，白芨三萜类化合物提取率达到最大，为0.644%。当超声波处理时间超过20 min 后，随着处理时间的延长，白芨三萜类化合物提取率呈直线下降，可能是因为超声波功率过大，溶液分子运动过快，有利于其他成分溶出，但是三萜类化合物结构被破坏，从而降低了三萜类化合物的提取率。因此，超声波辅助提取白芨三萜类化合物的最佳处理时间为20 min。

图3 超声波处理时间对白芨三萜类化合物提取率的影响

2.1.4 超声波处理温度对白芨三萜类化合物提取率的影响 从图4 可以看出，在超声波处理温度阶梯式的变更中，白芨三萜类化合物的提取率并不是随着温度的升高而升高，反而是呈下降趋势；当温度为40℃时，白芨三萜类化合物提取率最高，为0.646%。原因可能是随着提取温度的升高，乙醇的蒸发速率变快，溶剂量减少，导致三萜类化合物难以溶出，从而使提取率下降。因此，超声波辅助提取白芨三萜类化合物的最佳温度为40℃。

图4 超声波处理温度对白芨三萜类化合物提取率的影响

2.2 正交试验优化白芨三萜类化合物的提取工艺

根据单因素结果，选择乙醇体积分数为60%、70%和80%，料液比为1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50，超声波处理时间为10、20 和30 min，超声波处理温度为30、40 和50℃进行L9(34)正交试验（表2）。从表2中的极差（R 值）数据可以看出，各因素对白芨三萜类化合物提取率的影响程度由大到小排列依次为B ＞A ＞C ＞D，即对白芨三萜类化合物提取率影响最大的因素是料液比，其次是乙醇体积分数，超声波处理温度的影响稍小于超声波处理时间。从各因素不同水平的均值可以看出，白芨三萜类化合物提取的最佳工艺组合为A2B2C1D2，即最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1 ∶40、超声波处理时间10 min、超声波处理温度40℃。

表2 正交试验结果

2.3 白芨三萜类化合物的提取工艺验证试验

由于最佳工艺组合未出现在正交试验设计的处理中，为了进一步验证提取工艺的可行性和稳定性，在最优组合A2B2C1D2，即乙醇体积分数70%、料液比1 ∶40、超声波处理时间10 min、超声波处理温度40℃的试验条件下，平行重复3 次试验，结果如表3 所示，3 次试验白芨三萜类化合物的平均提取率为0.645%，且各重复的提取率均高于正交试验9 个处理中的最高提取率（0.626%），说明该工艺参数合理可靠，可作为白芨三萜类化合物的最佳提取工艺。

表3 验证试验结果

3 讨 论

三萜类化合物是由数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质，是一类含有多种生物活性成分的重要天然化合物，可加速红细胞破裂，具有抗癌症、抗炎症、抗微生物、降低胆甾醇以及杀灭贝类等软体动物的功效，已成为学术研究的热门方向之一[10]。提取三萜类化合物的方法从最早使用的传统热提取法，逐渐衍生出如索式抽提法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法、微波-超声波协同提取、化学衍生法、半仿生提取等新兴的提取方法[11]。该研究采用超声波辅助乙醇提取法，通过单因素试验和正交试验对白芨三萜类化合物提取工艺条件进行优化，结果表明，各因素对白芨三萜类化合物提取率的影响由大到小排列依次为料液比＞乙醇体积分数＞超声波处理时间＞超声波处理温度。在单因素试验中，最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1 ∶40、超声波处理时间20 min、超声波处理温度40℃；而在正交组合优化试验中，最佳工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1 ∶40、超声波处理时间10 min、超声波处理温度40℃；以此提取工艺条件进行验证试验，白芨三萜类化合物的平均提取率为0.645%。超声波提取法作为新的辅助提取手段，因其操作简便和高效率而受到众多研究人员的喜爱，但由于设备成本较高以及在提取过程中会有一部分的有机溶剂无法回收，还需在以后的研究中慢慢改进。