不同阴离子对乳酸链球菌素抑菌稳定性的影响研究

熊 玲，张立彦，刘启莲

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

乳酸链球菌素(Nisin)是一种天然多肽抗菌素类物质，是一种世界公认的、安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂［1］，主要用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鲜。但Nisin抗菌谱窄，其活性易受到温度、pH等因素的影响，且抗菌时效短［2］。保持Nisin的活性是其发挥作用的基础，Nisin在酸性条件下有着较好的热稳定性，但在高温处理时不可避免存在着活性损失［3］。因此，如何稳定Nisin的抑菌活性，延长其作用期限成为扩展其应用的重要课题。刘丽莉［4］等研究了不同的酸溶液、金属阳离子、离子强度及pH等非生物性因素对Nisin抗菌活性的影响，实验结果表明，乙酸对Nisin的抗菌活性的提高效果最显著;金属离子会提高Nisin的抗菌活性，离子强度的增加对Nisin的抗菌活性有较大的提高［5］。而不同阴离子对Nisin抑菌活性的影响还未见有研究报道。鉴于上述，本实验主要研究不同磷酸盐、柠檬酸钠和EDTA二钠在不同pH、温度条件下对Nisin的活性保护作用，旨在为Nisin在食品和医药业更广泛的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藤黄微球菌 生物试剂，广州环凯微生物科技有限公司提供;乳酸链球菌素 食品级，浙江银象生物工程有限公司提供;三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、EDTA二钠等 均为分析纯，购自天津市华苑产业区鑫茂科技园。

LDZX-30FA型手提式不锈钢蒸汽消毒器 江阴顶江机械设备有限公司;DF-101S型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限公司;DK98-1型恒温水浴锅 天津泰斯特仪器公司;BSD-150型水浴恒温振荡培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Model752型紫外可见分光光度计 上海现科分光仪器有限公司;SW-CJ-IF型无菌操作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Nisin效价测定

1.2.1.1 检测菌菌悬液的制备 用营养琼脂制得斜面培养基，将检测菌藤黄微球菌接种到斜面培养基，30℃培养48h。置于冰箱冷藏备用，储存期不超过14d。制备检测菌菌悬液时，用无菌生理盐水从斜面洗下检测菌接入300mL种子培养基(蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0，115℃灭菌 15min)中，稀释成浓度为107～108cfu/mL放入摇床中培养6h，转速150r/min，33℃。取出置于冰箱中备用，作为检测时的种子液。

1.2.1.2 CM检测培养基的制备 Tween20与水(体积比1∶1)混合物2g/L，胰蛋白胨8g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氢二钠2g/L，pH6.80，121℃灭菌 15min。

1.2.1.3 Nisin效价的测定 准确称取10mg Nisin标准品(103IU/mg)，溶于10mL 0.02 mol/L HCl中，配制成103IU/mL Nisin标准液备用。效价测定采用分光光度计法［6］测定。

1.2.1.4 Nisin效价损失率计算公式

其中，C1是指不经处理Nisin的效价，C2是指添加离子溶液后Nisin的效价。

1.2.2 温度和pH对Nisin抑菌稳定性的影响 现配好的Nisin标准液分别用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节至不同 pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)，之后在不同温度(30、45、60、75、90、110、121℃)下处理20min，以未经加热处理和未调节pH的Nisin标准液作为对照，一起进行抑菌效果实验。研究相应温度及pH下Nisin的效价损失率。

1.2.3 不同阴离子对Nisin抑菌稳定性的影响 将0.1mol/L的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、EDTA二钠、三聚磷酸钠、柠檬酸钠、六偏磷酸钠溶液，按一定的添加量添加到配好的Nisin标准液中，分别调节至不同的 pH(2.0、4.0、5.5、6.0、6.5、6.8)，然后分别在不同温度(30、45、60、75、90、110、121℃)下保持 20min，测定其效价，考察在不同温度及pH下，不同离子对Nisin抑菌稳定性的影响。

2 结果与讨论

2.1 温度和pH对Nisin抑菌稳定性的影响

由图1可看出，随着温度的升高，Nisin的效价损失率也随之逐渐升高，其抑菌活性减弱。当pH在2.0～4.0时，Nisin的效价损失率在30℃时几乎无损失，之后随着温度的升高逐渐升高。当pH5时，在30～60℃，效价损失率在25%左右，到121℃时接近70%。当pH分别为6.0、7.0时，在30℃下的效价损失率就已经较大，121℃时几乎接近100%，基本完全丧失活性。总的来说，在强酸性环境下，低温对Nisin活性的影响不大，但在高温时，其稳定性显著降低，在偏中性环境下，Nisin的活性损失更为严重，温度对其影响要比在强酸性环境下温度的影响要大得多。由此可知，温度和pH对Nisin的抑菌稳定性有很大影响。

2.2 磷酸二氢钠对Nisin抑菌稳定性的影响

图1 温度及pH对Nisin活性的影响Fig.1 Effect of temperature and pH on the activity of Nisin

如图2所示，添加磷酸二氢钠后，Nisin的效价损失率也随着温度的升高而逐渐升高。在强酸性范围(pH2.0～4.0)，Nisin活性随温度的升高而降低，但变化较不添加时(图1)缓慢，如121℃、pH4.0时，效价损失率由未加时61.6%降至41.4%，说明磷酸二氢钠的添加对Nisin的活性有一定的保护作用。在pH5.0～6.5范围内，Nisin活性随温度升高而快速降低，且温度一定时，Nisin活性损失与处理pH呈正相关，即pH越大，活性损失越严重。这可能是因为磷酸二氢钠属于正磷酸盐，它的螯合作用和持水作用是磷酸盐中最弱的，对Nisin分子的活性基团的保护作用有限。

图2 磷酸二氢钠对Nisin活性的影响Fig.2 Effect of sodium dihydrogen phosphate on the activity of Nisin

2.3 磷酸氢二钠对Nisin抑菌稳定性的影响

如图3所示，添加磷酸氢二钠后，Nisin的效价损失率仍随着温度升高而逐渐升高。在低温范围内(30～75℃)，Nisin活性的变化趋势较为平缓，而当温度继续升高时，其活性损失也急剧增大。Nisin的抑菌稳定性变化趋势与添加磷酸二氢钠时基本一样，但在低温时抑菌效果不如磷酸二氢钠。如在pH5.5，30℃时，添加了磷酸氢二钠的Nisin效价损失率为32.6%，而添加磷酸二氢钠的效价损失率仅为18.2%。但是在高温、高pH范围内，两者的作用效果差不多，Nisin活性损失都比较严重，对Nisin活性几乎没有保护作用，如在pH6.0～6.8范围内，121℃温度下保持20min，效价损失率几乎达到100%。

2.4 EDTA二钠对Nisin抑菌稳定性的影响

如图4所示，添加EDTA二钠时，Nisin效价损失率随着温度的升高而逐渐升高，但在强酸性范围(pH2.0～4.0)变化很缓慢，在弱酸性及近中性范围(pH5.5～6.8)内变化则相对较快;随着pH的升高，Nisin效价损失率也基本呈现逐渐升高的趋势。但是，即使在高温、高pH的条件下，效价损失率还是非常低的，最高也仅为10.2%，其保护作用远远超过NaH2PO4和Na2HPO4。因此，EDTA二钠对 Nisin的活性具有极强的保护作用，可能是因为它结合Nisin分子阻碍了藤黄微球菌正常的细胞壁合成［7］。T.Economou［8］等研究了EDTA二钠对Nisin抑菌稳定性的影响，结果表明50mmol/L的EDTA二钠对Nisin抑菌稳定性有很强的保护作用，与本实验的结果相一致。EDTA二钠作为一种螯合剂，可与充当膜上大分子如脂多糖之间盐桥二价阳离子螯合，使细菌的细胞膜失稳，从而具有一定的抗菌效果。但据杨万根［9］、杜琨［10］等人的报道，认为单独使用EDTA二钠的杀菌效果并不明显，其只有与Nisin或溶菌酶复合使用时才表现出一定的协同作用。

图3 磷酸氢二钠对Nisin活性的影响Fig.3 Effect of sodium hydrogen phosphate on the activity of Nisin

图4 EDTA二钠对Nisin活性的影响Fig.4 Effect of EDTA-Na2on the activity of Nisin

2.5 柠檬酸钠对Nisin抑菌稳定性的影响

如图5所示，添加柠檬酸钠后Nisin效价损失率受温度和pH的影响变化趋势和未添加的类似，即随着温度和pH的升高效价损失率降低(90℃、110℃时pH6.5和pH6.8之间例外)。

图5 柠檬酸钠对Nisin活性的影响Fig.5 Effect of sodium citrate on the activity of Nisin

与图1对比可知，添加柠檬酸钠后Nisin的效价损失率有下降的趋势，如pH4.0、75℃时，未添加柠檬酸钠的Nisin效价损失率为30%，添加柠檬酸钠之后为22%，效价损失率降低了26.67%;pH6.0、90℃时，未添加柠檬酸钠的Nisin效价损失率为89%，添加柠檬酸钠之后为75%，效价损失率降低了15.73%。说明柠檬酸钠对Nisin也起到了一定保护作用，其保护作用强于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，但远远弱于EDTA二钠。

2.6 三聚磷酸钠对Nisin抑菌稳定性的影响

如图6所示，效价损失率随着温度的升高而逐渐升高;在相同温度下，pH越大，效价损失率越大。但是，对比发现添加三聚磷酸钠后Nisin的效价损失率比未添加时有大幅度降低，如pH6.0、121℃时Nisin的效价损失率由未添加的91%降至56%，下降幅度为38.46%，其他条件下Nisin的效价损失率也分别有较大幅度的下降，说明三聚磷酸钠对Nisin的抑菌稳定性起到了积极的保护作用，其保护效果强于磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和柠檬酸钠，强于前两者是因为磷酸盐的作用特性与链长有关［11］。P2O5在三聚磷酸钠中的含量比正磷酸盐高，脱水聚合方式不同导致三聚磷酸钠的链长(聚合度)比正磷酸盐大，而磷酸盐对Nisin保护效果又与链长成正比，链长越长，作用越显著。但是三聚磷酸钠的作用效果不如EDTA二钠的强。

图6 三聚磷酸钠对Nisin活性的影响Fig.6 Effect of sodium tripolyphosphate on the activity of Nisin

2.7 六偏磷酸钠对Nisin抑菌稳定性的影响

如图7所示，添加了六偏磷酸钠后Nisin效价损失率比未添加时有了很大降低，损失率均在8%以下。如在pH4、60℃下，Nisin的效价损失率由未添加时的26%降为0.2%，说明六偏磷酸钠对Nisin起到了很强的保护作用，减少了其效价损失。分析上述曲线可以发现，在酸性条件(pH2～5.5)下，Nisin的效价损失率保持较低水平，温度低于60℃时，几乎没有效价损失。在偏中性条件(pH6.0～6.8)下，Nisin效价损失率明显高于偏酸性条件，突变 pH范围为5.5～6.0。总的来说，由于六偏磷酸钠的保护作用，整体损失率并不高，可能是因为六偏磷酸钠改变了Nisin分子中的疏水及静电结合，扩大相邻分子空间，增加了保水性，另外促使Nisin的亲水基团露出，可以吸收更多的水分，形成了保护膜，保护了Nisin的活性［12］。与前面的几种物质比较，六偏磷酸钠对Nisin抑菌稳定性的作用效果最显著，明显高于其他磷酸盐和柠檬酸钠。

图7 六偏磷酸钠对Nisin活性的影响Fig.7 Effect of sodium hexametaphosphate on the activity of Nisin

3 结论

3.1 pH、温度对Nisin抑菌稳定性有较大影响，随着处理温度及pH的升高，Nisin的效价损失率随之升高，其抑菌活性减弱。

3.2 不同含钠阴离子(磷酸盐、EDTA二钠、柠檬酸钠)对Nisin的抑菌活性有一定的保护作用，且保护效果由大到小排序为:六偏磷酸钠＞EDTA二钠＞三聚磷酸钠＞柠檬酸钠＞磷酸二氢钠＞磷酸氢二钠。六偏磷酸钠在pH=6.8、121℃条件处理下，Nisin效价损失率为7.25%，相同条件下EDTA二钠为10.2%。

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