代谢组学在转运蛋白的生物体内功能分析中的应用

金井好克，何 新

（1.日本；2.天津中医药大学，天津 300193）

转运蛋白是一种参与小分子化合物跨细胞膜转运的膜蛋白，对体内物质分布起着决定性作用，当转运蛋白的表达量和功能出现变化或异常时都会引起体内物质分布的改变。代谢组学的兴起和发展使生物体内转运蛋白功能的认知成为可能。代谢组学能够解析孤儿转运蛋白的功能，使转运蛋白的新功能与疾病的关联性得以阐释。代谢组学必将为后基因组研究带来重大突破。

20世纪90年代分子克隆研究的重大进展推进了转运蛋白分子结构的解析。转运蛋白分为ABC转运蛋白和SLC转运蛋白两大类。ABC转运蛋白因具有特征性的ATP Binding cassette而得名，其能够水解ATP，实现有机物的主动转运。除ABC转运蛋白之外（即不含ATP Binding cassette）的转运蛋白统称为SLC转运蛋白，截止目前已划分为51个家族、包括378个成员分子，其中多数孤儿转运蛋白的功能尚未确定，虽然体外研究中发现某种机制，但其在生物体内的机制仍不明确。确定转运蛋白在生物体内的功能已成为后基因组时代研究转运蛋白分子评价的重要终极目标之一，分子克隆解析为达成此目标提供了颇具意义的重要信息。

1 以往转运蛋白研究中存在的问题

如前所述，目前转运蛋白的分子组成已基本明确，未来的研究方向是转运蛋白的功能以何种结构为基础实现、以及转运蛋白如何在生物体内发挥作用。对于前者，结构生物学可以给出答案，但对于后者，生物体内真实底物的鉴定与转运蛋白功能的定量测定技术是必不可少的。将纯化后的cDNA导入至非洲爪蛙卵母细胞或哺乳动物细胞的基因表达系统中，根据放射性标记的底物摄取情况分析分子克隆后的转运蛋白功能。这种体外分析过程依赖于研究者选择的理想底物，难以排除人为的随意性。这种研究模式不能阐明特定转运蛋白的最适底物，也无从确定在生物体内转运的究竟是不是这个底物。要脱离现今这种“猜谜”式研究模式，必须正确表达转运蛋白在生物体内的实际功能，并采用详尽的分析方法。代谢组学能够全面定量探测化合物的变化，使转运蛋白的在体研究成为可能。

2 代谢组学用于转运蛋白研究的实例

为了建立生物体内转运蛋白功能的代谢组学研究方法，简单而言，首先要使特定转运蛋白的表达发生大幅度变化，检测由此造成的代谢组学变化，再讨论转运蛋白功能与代谢组学的相关性。现代转运蛋白功能分析中一般采用基因敲除小鼠，将其代谢组与野生型小鼠相比较，结果清晰易得。也可采用基因过表达小鼠或大鼠，已有相关成功案例的报道。目前代谢组学正处于转运蛋白研究的初级阶段，转运蛋白的活性可以直接体现出来，比如肾小管转运蛋白基因敲除小鼠的尿检简单易行，也可检测转运蛋白基因敲除小鼠或转基因大鼠血液或组织中的成分变化。

代谢组学用于转运蛋白研究的另一个决定性理由是代谢组学定量性良好，特别是对于小鼠尿液等微量样品也能以高灵敏度的方法进行测定。毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）法可用于微量样品的定量分析，可以预见这种联用技术将为转运蛋白的研究再次带来重大突破。由于代谢组学研究综合全面性的特点，与体外功能分析研究结果相比可能会获得一些意想不到的信息。

笔者鉴定SLC 22家族孤儿转运蛋白的功能时采用了CE-MS代谢组学的方法。有机酸转运蛋白家族的底物极为多样，转运底物多难猜测，因此多数转运蛋白功能不明。SLC 22家族包括多个有机酸转运蛋白，其中一部分与已知功能基因表达的转运蛋白不同。笔者以其中之一的OATN1为研究对象，考察其组织分布，发现OATN1为肾脏独有的转运蛋白，存在于近曲小管的管腔侧膜中，但基因敲除小鼠的表现型不明显，未找到特定功能的分析线索。

OATN1转运蛋白存在于肾小管管腔侧膜中，与尿液直接接触，因此其功能的改变应该能够通过尿液成分的变化表现出来，于是笔者以CE-MS法全面分析比较了基因敲除小鼠与野生型小鼠的尿液成分。CE-MS法可分析测定小鼠尿液（每次强制排尿50 μL左右）等微量样品，以带电荷的化合物为检测对象，因此适于分析转运蛋白的底物。以CE-MS法分析测定OATN1基因敲除小鼠的尿液，与野生型小鼠相比，检出71个有差别的峰。以飞行时间质谱仪（TOFMS）测定每个峰的精确分子量，解析出每个峰对应的化合物的示性式，再根据MS/MS解离结果推测示性式的结构，结构中有多个同分异构体时，推测生物体内可能存在的异构体，购买已知化合物作为对照品，确认购得化合物的峰与目标峰是否能够重合，如果重合则解析成功。按上述过程进行解析，71个峰中的17个峰成功解析。这些化合物中除了OATN1的原本底物之外，也包括OATN1基因敲除小鼠的次生变化产物，需要进一步将两者区分，因此笔者又进行了抑制实验。培养稳定表达OATN1基因细胞，采用已知的OATN1底物14C标记的βhydroxybutyrate，建立OATN1稳定表达细胞摄取实验系统，观察17个已解析的化合物能否抑制OATN1介导的14Cβ-hydroxybutyrate的摄取。结果显示，17个化合物中有8个化合物强烈抑制OATN1介导的14C β-hydroxybutyrate的摄取，4个化合物的抑制作用较弱，5个化合物完全没有抑制作用。抑制标记物转运的化合物很可能是转运蛋白直接作用的化合物，不抑制标记物转动的化合物可能是转运蛋白基因敲除小鼠次生变化产生的化合物，不属于转运蛋白的底物。按上述方法锁定了12个底物候选化合物，又考察了OATN1稳定表达细胞对2个放射标记物（β-hydroxybutyrate和乳酸）的摄取，发现OATN1对两者有显著摄取作用。如上所述，通过代谢组学阐明了未知转运蛋白的功能。其他没有放射标记的10个化合物是底物的潜在候选物。OATN1属于SLC 22家族，一般来说SLC 22家族转运蛋白的底物选择范围较宽，通过上述研究可推测OATN1在生物体内携带转运多个底物。

β-hydroxybutyrate是代谢组学确定的底物之一，属于酮体，因此明确了OATN1对体内酮体的转运功能。当饥饿或糖尿病发作时，细胞不能充分利用葡萄糖，酮体转化为乙酰辅酶A，参与三羟酸循环（TCA）。脂肪酸在肝脏中经β-酸化生成酮体，释放入血液。酮体作为重要能量源，经肾小球滤过进入原尿，再经肾小管重吸收保留在体内，OATN1可能在其中发挥了重要作用。糖尿病患者酮体浓度大幅升高，造成血液pH下降(糖尿病酮症酸中毒)，引起全身状态恶化，因此可以转运蛋白为分子靶点，通过抑制该转运蛋白使酮体从尿中排出，防止血液pH值降低。

3 结语

转运蛋白决定着体内小分子化合物的分布，抑制其活性可纠正疾病造成的体内物质失衡，成为治疗疾病的分子靶点。实际上，抗抑郁药、利尿药、降血脂药等已包含了转运蛋白抑制剂。葡萄糖转运蛋白负责肾小管的葡萄糖重吸收，最近葡萄糖转运蛋白抑制剂作为糖尿病治疗药正处于临床研究中。中药中含有多种作用于转运蛋白的化学成分，代谢组学完全适用于评价这些成分的药效。通过研究服用中药后代谢组学的变化，从中预测与之相关的转运蛋白，分析数据建立与转运蛋白直接相关的实验方案。代谢组学分析是转运蛋白研究的有力工具，转运蛋白决定着体内小分子化合物的分布，代谢组学技术全方位定量测定小分子化合物的变化，精确呈现转运蛋白介导的物质分布。不论是否作用于转运蛋白，服用中药后代谢组学变化也为中药药效自身的阐释提供了极为有益的参考，此领域的未来发展令人期待。