手足口合剂质量标准的建立

林 宏，张 囡，陈双璐，钱宇坤

（天津市儿童医院，天津 300074）

手足口合剂为本院应用4年的协定处方制剂，由黄芩、黄连、黄柏、蝉蜕、栀子、淡竹叶、蒲公英、僵蚕等多味中药组成，具有泻火解毒、解肌透疹的功效[1]，临床用于手足口病的治疗，可有效缓解症状，控制病情发展，已治愈了近千例患儿，取得了良好的疗效，受到广大患儿家长的欢迎。

方中黄芩为君药，其主要作用为清热解毒凉血，常与黄连、栀子等配伍退热疗效显著。现代药理研究其有解热、镇静、抗微生物等作用。相关的研究报道[2-5]：黄芩苷含量测定方法有紫外分光光度法、薄层扫描法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）法、毛细管电泳法、离子色谱法（PIC）等。为了有效控制产品质量，笔者采用TLC法对方中黄芩、栀子、黄柏、蒲公英、黄连进行了鉴别，采用高效液相色谱法对黄芩苷进行了含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）；LCsolution色谱工作站；双频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；三用紫外分析仪（天津思利达色谱技术开发中心）。

1.2 试药 黄芩苷对照品（批号110715-200815，供含量测定用）、盐酸小檗碱对照品（批号110821-200609）、栀子苷对照品（批号 110749-200714）、咖啡酸对照品（批号110885-200102）、黄连对照药材、黄柏对照药材、蒲公英对照药材均由中国药品生物制品检定所提供；色谱分析用甲醇、冰醋酸为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其他试剂为化学纯；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；手足口合剂（本院自制）。

2 薄层鉴别

2.1 黄芩 取黄芩苷对照品，加入甲醇适量，制成浓度为1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。再取手足口合剂50 mL，置于水浴，蒸至约余10 mL，取出后，用稀盐酸调节至pH值约为1，再用乙酸乙酯萃取2次，每次用量为20 mL，合并2次的乙酸乙酯液萃取液，经减压蒸干，将残渣中加2 mL甲醇，并使溶解，此溶液作为供试品溶液。根据处方比例，称取除黄芩外的其余药材，按合剂的制备工艺制成阴性样品，再按照供试品溶液的制备方法，制得无黄芩的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开距薄层板前沿8 mm处，取出，晾至全干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液显色。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无相应斑点。结果见图1。

图1 黄芩的薄层色谱图Fig.1 TLC atlas of Baicalin

2.2 黄连与黄柏 取盐酸小檗碱对照品，加甲醇适量，制成浓度为0.2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液；再分别称取黄柏对照药材及黄连对照药材各0.03 g，各加入甲醇3 mL，置超声波清洗器中，超声处理30 min后，滤过，取滤液作为对照药材溶液。另取手足口合剂15 mL，置于蒸发皿中，加入硅藻土3 g，研匀，置于水浴上蒸至近干，残留物中加入15 mL甲醇，置超声波清洗器中，超声处理30 min后，滤过，采用减压旋转蒸发将滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL，轻摇10秒，共摇2次即可，取上清液，作为供试品溶液。根据处方比例，称取除黄连和黄柏的其余药材，按合剂的制备工艺制成阴性样品，再按照供试品溶液的制备方法，制得无黄连与黄柏的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述5种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）做为展开剂，将薄层板展开至距前沿8 mm处，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点，阴性对照溶液无相应斑点。结果见图2。

图2 黄连与黄柏的薄层色谱图Fig.2 TLC atlas of Coptis and Cortex Phellodendri

2.3 栀子 称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成浓度为1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。另取手足口合剂30 mL，用水饱和正丁醇振摇萃取3次，第1、2次用量为 20 mL，第 3次用量为 10 mL，合并3次的正丁醇提取液（A液），再用25 mL氨试液洗涤上述A液，弃去氨试液，继续用经正丁醇饱和的水溶液洗涤A液，共2次，每次用量为25 mL，弃去水溶液，取正丁醇液，加入适量的无水硫酸钠，过滤，滤液减压蒸干，加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液。根据处方比例，称取除栀子以外的其余药材，按合剂的制备工艺制成阴性样品，再按照供试品溶液的制备方法，制得无栀子的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用三氯甲烷-甲醇（11∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无相应斑点。结果见图3。

图3 栀子的薄层色谱图Fig.3 TLC atlas of Fructus Gardeniae

2.4 蒲公英 称取咖啡酸对照品适量，加入甲醇，制成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。另取蒲公英对照药材1 g，加乙酸乙酯10 mL，置超声波清洗器中超声提取20 min，过滤，滤液经减压蒸干，取残渣加入甲醇1 mL，使溶解，作为对照药材溶液。取手足口合剂30 mL，用乙酸乙酯振摇萃取2次，每次用量为20 mL，合并2次的乙酸乙酯提取液，经减压蒸干，取残渣加入甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。根据处方比例称取除蒲公英以外的其余药材，按合剂的制备工艺制成阴性样品，再按照供试品溶液的制备方法，制得无蒲公英的阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，分别吸取对照品溶液、对照药材溶液、样品溶液、阴性对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无相应斑点。结果见图4。

3 含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱：Shim-packVP-ODS(150mm×

图4 蒲公英的薄层色谱图Fig.4 TLC atlas of Dandelion

4.6 mm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（40∶60∶1）；检测波长：280 nm；柱温：40 ℃ ；流速：1.0 mL/min；进样量：10μL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。

3.2 溶液制备

3.2.1 供试品溶液的制备 精密量取手足口合剂5 mL，置100 mL量瓶中，加稀乙醇（按照《中国药典》2010年版一部附录配制）适量，超声处理30 min，放冷至室温，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液。

3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取经干燥后的黄芩苷对照品2.25 mg，置50 mL量瓶中，加入稀乙醇30 mL，置超声波清洗器中超声15 min使溶解，取出，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度45μg/mL的黄芩苷对照品溶液。

3.2.3 阴性对照溶液的制备 根据处方比例，称取除黄芩外的其余药材，按合剂的制备工艺制成无黄芩的阴性样品，再按照供试品溶液的制备方法，制成阴性对照溶液。

3.2.4 专属性实验 分别吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液，分别按照上述色谱条件进样，记录3份溶液的色谱图，见图5。结果表明，供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处有一黄芩苷峰色谱峰，而阴性对照溶液在该处未出现色谱峰，对测定无干扰。理论塔板数按黄芩苷峰计算均大于5000；分离度符合要求。

3.3 线性关系考察 分别精密量取黄芩苷对照品溶液（45 μg/mL）6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 μL，依次注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进样，测定各自峰面积。以对照品的进样量X（μg）为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析，得黄芩苷的回归方程为：Y赞=2849744.13X-13379，r=0.99996，表明黄芩苷进样量在 0.270～0.720 μg 范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

3.4 精密度实验 精密吸取黄芩苷对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照上述色谱条件分析，测定峰面积，测得黄芩苷平均峰面积为1267629.3，RSD为0.30%，表明仪器精密度良好。

3.5 重复性实验 取手足口合剂样品（20111101）适量，共6份，按照文中3.2.1方法制备供试品溶液并测定，计算样品含量。结果测得样品中黄芩苷平均含量为1.249 mg/mL（RSD=0.46%），表明方法的重复性良好。

3.6 稳定性实验 取重复性实验中第1号供试品溶液 10 μL，分别在 0、2、4、6、8、10 h 进样测定，测得黄芩苷平均峰面积为1758688（RSD=0.51%），表明供试品溶液在10 h内稳定。

3.7 加样回收率实验 精密量取2.5 mL手足口合剂样品（20111101）6份，分别置100 mL量瓶中；再加入浓度为0.1210 mg/mL的黄芩苷稀乙醇溶液10 mL，按文中3.2.1方法处理，制得供加样回收试验用供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果黄芩苷的平均加样回收率为100.8%（n=6），RSD=1.11%。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery testmg

3.8 样品测定 取3批手足口合剂样品（批号为20111101、20111102、20111201），按上述供试品溶液制备方法操作，按“3.1”项下色谱条件测定，进样10 μL测得样品中黄芩苷含量分别为：1.249、1.258、1.237 mg/mL。

4 讨论

黄芩、黄连、栀子、蒲公英、黄柏为本方中主药，故对此5种药进行定性鉴别，在制订薄层鉴别方法时，从样品制备、展开剂组成及比例的选择、点样量等方面，对几味药材的薄层色谱条件进行了优化，参考相关的文献报道[6-8]，选择了最佳的实验条件，方法简单、可靠。

蒲公英的鉴别，笔者曾参考文献报道[8]，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）为展开剂，样品溶液中各组分的分离度不理想，最终选用乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上层溶液为展开剂,取得良好的分离效果。

黄柏与黄连的鉴别中，曾以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂[9-10]，也曾选用甲苯-异丙醇-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（12∶3∶6∶3∶1）为展开剂，另槽中加入等体积的浓氨试液，预饱和15 min后，进行展开，最终确定以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）为展开剂，无论在展开速度、分离效果以及环保等方面都略胜一筹。

黄芩作为该制剂的君药，对其主要活性成分黄芩苷进行含量测定，能够准确的反映制剂制备过程中工艺的完成情况，从而有效地控制产品质量。黄芩苷极性较大，可均一、稳定地溶解于水中，考虑到成品制剂工艺中无醇沉步骤，不宜使用稀醇溶液进行稀释，故确定用水直接稀释定容后测定黄芩苷含量。该方法经济、环保，而且满足定量分析准确度的要求。

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