高效液相色谱法同时测定青蒿绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯含量*
2012-11-29孙玉刚秦续文王振中成志东常艳旭
孙玉刚 ,秦续文 ,张 玲 ,李 晋 ,萧 伟 ,王振中 ,成志东 ,常艳旭 ,,3
(1.天津中医药大学,天津市现代中药重点实验室,天津 300193;2.江苏康缘药业股份有限公司博士后工作站,连云港 222001;3.天津中医药大学中医药研究院,中药化学与分析重点实验室,天津 300193)
青蒿为菊科植物黄花蒿(Artemisia annua L.)的干燥全草,具有清热解毒[1]、抗疟等功效[2]。青蒿药用历史悠久,在全国各地均有分布。研究表明青蒿素及其衍生物是青蒿抗疟的主要有效成分,并被研制成抗疟新药,是世界卫生组织(WHO)推荐的治疗疟疾的首选药物。同时,青蒿作为常用中草药,是临床有效中药热毒宁注射液的重要组成部分,在热毒宁注射液临床疗效起着重要的作用。
青蒿的化学成分种类较多,主要有黄酮类、香豆素、萜类、苯丙酸类和挥发油[3]。绿原酸、隐绿原酸作为热毒宁注射液有效成分[4],在青蒿有分布[5]。香豆素成分可能是青蒿解热降温疗效的有效部位[6],主要有东莨菪内酯、香豆素等。目前,青蒿中青蒿素、黄酮类和香豆素类成分均有含量测定的报道[7-9],但是绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯同时测定方法未见报道。本实验首次建立了高效液相色谱法(HPLC)同时测定青蒿中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯含量的方法,并对人工种植青蒿中以上3种成分含量进行测定,拟为青蒿药材的规范化种植及质量评价提供研究手段。
1 仪器与试剂
Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2487双波长检测器,Agilent Zorbax SB-C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。甲醇和乙腈为色谱纯(天津康科德科技有限公司),水为重蒸馏水,其余试剂均为分析纯。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯等标准品购自成都曼斯特生物技术有限公司,经色谱法检测纯度在98%以上。6批青蒿样品采自江苏康缘药业股份有限公司东海县青蒿基地(2010年10月),自然晒干,含量测定前60℃下烘干12 h,粉碎后过100目筛,得粉末。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:A 乙腈,B 0.1%甲酸水;梯度洗脱程序:0~6 min,9%~10%A;6~12 min,10%~11%A;12~25 min,11%~12%A;25~30 min,12%~13%A;30~35 min,13%~13%A;9%A 平衡5 min流速:1.0 mL/min;检测波长:325 nm;进样量:10 μL;柱温:35 ℃。
2.2 对照品溶液的制备 取绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯对照品适量,精密称定,加60%甲醇溶解并稀释,制成浓度分别为30.9、31.2、30.3 μg/mL混合对照品液。
2.3 供试品溶液的制备 取青蒿粉末0.30 g,精密称定,置10 mL容量瓶中,加入60%甲醇定容至刻度,称质量,超声60 min,放冷,称定质量,用60%甲醇补足失质量,摇匀,14000 r/min离心10 min,取上清液,作为供试品溶液。
3 结果
3.1 色谱条件的优化 色谱条件考察时,选择乙腈-水作为流动相,结果发现样品的色谱峰分离度较差并且有一定拖尾现象。经多次实验后,最终确定以乙腈-0.1%甲酸溶液作为含量测定的流动相,采用梯度洗脱,所得色谱峰峰形尖锐,分离度高,见图1。
3.2 样品提取条件的优化 本研究采用了单因素分析方法,考察了超声波法制备供试品溶液条件,比较了不同提取时间(20、30、40、50、60、80 min)、不同提取溶液甲醇浓度(40%、60%、80%、100%)对绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯提取的影响,研究结果表明,3种有效成分随着超声时间的延长提取率变高,但在60 min时3种有效成分含量较高;而随着甲醇浓度的升高,有效成分的提取率呈先上升后下降的趋势,60%甲醇提取效果最好,因此,最后确定以60%甲醇超声提取60 min为最佳提取条件。
3.3 方法学考察
3.3.1 线性范围、标准曲线、定量限、检测限 精密称取绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯对照品适量,配制一系列不同浓度的对照品溶液,分别进样10 μL,按上述色谱条件测定其峰面积各个化合物的峰面积。以化合物进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯标准曲线分别为Y赞=19 327X+u="1(r=0.9999)、Y赞=10 063X-339.2(r=0..2(=)、Y赞=17 606X-7606(r=0.9999),线性范围分别为 0.515~30.900、0.520~31.200、0.501~30.300 μg/mL,检测限分别为 0.103、0.104、0.202 μg/mL,定量限分别为 0.31、0.32、0.60 μg/mL。
3.3.2 精密度实验 取同一供试品溶液,连续进样6次,测定其浓度,计算它们的相对标准偏差。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯RSD分别为0.8%、1.7%和1.5%,表明该系统进样精密度良好。
3.3.3 重复性实验 取同一批样品,制备供试品溶液6份,测定其浓度,计算它们的相对标准偏差。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯RSD分别为2.8%、2.9%和2.8%,表明方法重复性好。
3.3.4 稳定性实验 取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12、24 h 进样,测定其浓度,计算其相对标准偏差。绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯RSD分别为2.7%、2.8%和2.8%,表明样品溶液在24h内稳定。
3.3.5 加样回收率 取已知含量的青蒿样品粉末6份,每份约0.15 g,精密称定,分别加入适量绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯对照品,供试品溶液制备方法制备,并依法测定。计算回收率,结果表明绿原酸的平均回收率为100%,RSD为1.9%,隐绿原酸的平均回收率为102%,RSD为2.5%,东莨菪内酯的平均回收率为99.7%,RSD为2.7%,说明绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯的提取和检测方法可行。
以上青蒿有效成分定量方法学考察结果表明,该方法精密度、重复性、回收率结果均较好,能够准确、快速地测定青蒿药材中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯3种成分的含量。
3.4 样品测定 分别吸取对照品溶液和6批人工种植青蒿的供试品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,并计算绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯的含量。结果见表1,可知人工种植青蒿绿原酸含量在(0.532±0.185)mg/g,隐绿原酸含量在(0.119±0.016)mg/g,东莨菪内酯在(0.78±0.09)mg/g,人工种植青蒿有效成分相对比较稳定。
4 讨论
本实验建立了高效液相色谱法同时测定青蒿中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯含量的方法,并对其进行了方法学考察。结果显示该方法准确度高,专属性强、灵敏度及稳定性均较好,测定结果能客观准确地反映青蒿药材中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯的含量。
表1 人工种植青蒿绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯含量测定结果Tab.1 Result of chlorogenic acid,cryptochlorogenic acid and scopoletin content of cultivated A.Annua L mg/g
测定结果表明,人工种植青蒿中东莨菪内酯含量最高,绿原酸次之,隐绿原酸最低。青蒿中绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯是热毒宁注射液中重要的药效成分,对其含量测定方法的研究,有利于从原材料对热毒宁注射液进行质量控制。
本实验对人工种植青蒿中的绿原酸、隐绿原酸和东莨菪内酯3种有效成分进行了测定,今后还将对种植密度和环境条件对青蒿中3种有效成分含量的影响和不同生育期变化规律做进一步研究,为青蒿规范化种植提供科学依据。
[1]王 建,李 锦,孙 瑜,等.GC-MS鉴别清热抗感颗粒中青蒿、荆芥穗和薄荷[J].天津中医药大学学报,2007,26(4):210-212.
[2]肖培根.新编中药志(第三卷)[M].北京:化学工业出版社,2001:154.
[3]张秋红,朱子微,李 晋,等.中药青蒿化学成分与种植研究现状[J].中国医药导报,2011,8(19):10-12.
[4]毕宇安,王振中,宋爱华,等.热毒宁注射液高效液相色谱指纹图谱研究及多成分定量分析[J].世界科学技术·中医药现代化,2010,12(2):298-303.
[5]宫毓静,闫 寒,李爱媛,等.青蒿总香豆素解热作用及其机理初步研究[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(12):49-52.
[6]夏铮铮,李 劲,张小松.黄花蒿中青蒿素含量测定方法的研究进展[J].西部药学,2006,3(1):40-41.
[7]李 敏,王佳黎,吴蜀瑶.高效液相色谱法测定青蒿不同部位山柰素含量[J].时珍国医国药,2008,19(10):2425-2426.
[8]薛洪宝,焦艳娜,庞国伟,等.青蒿中6种成分同时定量的高效液相色谱法研究[J].四川大学学报(工程科学版),2009,41(4):119-124.
[9]吴蜀瑶,李 敏,王佳黎.HPLC测定青蒿植株不同部位的东莨菪内酯含量[J].中国现代中药,2010,12(6):20-22.