抑癌基因WWOX与相关基因p73、Bax在结直肠癌中的表达及意义

陈志英，何 常，李 佽，刘 莉，刘都礼

(1.成都大学附属医院病理科，四川 成都 610081;2.贵阳医学院病理学教研室，贵州 贵阳 550004)

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一。在我国，随着生活水平提高，饮食习惯改变，结直肠癌的总体发病率也呈上升趋势。大量研究表明，结直肠癌的发生发展是由多因素引起，多基因参与并经历了多阶段的演变过程。本研究应用免疫组化法对结直肠癌中含有WW结构域的氧化还原酶基因(WW domain containing oxidoreductase，WWOX)、p73 及Bax的表达进行研究，探讨它们在结直肠癌发生发展中的作用及其相互关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集贵阳医学院病理科1994～1998年结直肠癌手术切除标本共计348份，选取其中临床及随访资料完整并且术前均未经化疗和放疗的同一组织学类型及治疗方法相同病例的58份标本;同时收集同期结直肠黏膜炎症标本20份作对照。所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4 μm。

1.2 试剂及方法 浓缩型兔抗人多克隆抗体WWOX为英国Abcom公司产品，工作浓度为1∶300;浓缩型鼠抗人单克隆抗体Bax为北京中杉生物技术有限公司产品，工作浓度为1∶300;浓缩型兔抗人多克隆抗体p73为武汉博士德生物工程有限公司产品，工作浓度为1∶100;Envision二步法免疫组化检测试剂盒及浓缩型DAB试剂盒均购于北京中杉生物技术有限公司。所有染色均进行高温高压抗原修复。

1.3 结果判定 主要以细胞浆染色有清晰淡黄色至棕黄色颗粒为阳性，胞核偶见着色。每张切片于显微镜下随机观察10个高倍视野，计算阳性细胞数占细胞总数的均值(不足10个视野的，以可以观察到的最多高倍视野计算)。阳性结果判定根据以下两方面的总分进行判断:①选染色均匀的阳性表达肿瘤区域，以阳性细胞所占百分比分五级计分:阳性细胞率＜5%计0分;阳性细胞率5% ～25%计1分;阳性细胞率26% ～50%计2分;阳性细胞率51% ～75%计3分;阳性细胞率＞75%计4分。②按染色强度来分:不着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。两种评分相加，0～1分为阴性(－)，2～7分为阳性(+)。以上方法均由两名病理医师采用双盲法独立检测，取平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 11.5软件包进行分析，癌组织与炎症对照组织间蛋白表达的比较及癌组织中WWOX蛋白表达与临床病理特征的关系用χ2检验，蛋白间相关性用χ2关联性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WWOX、p73、Bax在不同结直肠组织中的表达 表1显示，WWOX在结直肠癌中的表达明显低于炎症组织，两组比较差异具有统计学意义(χ2=9.900，P＜0.01);Bax在结直肠癌中的表达明显低于炎症组织，两组比较差异具有统计学意义(χ2=4.572，P＜0.05);p73在结直肠癌中的表达明显高于炎症组，两组比较差异有统计学意义(χ2=6.866，P ＜0.01)。

表1 结直肠癌及结直肠黏膜炎症中WWOX、p73及Bax的表达

2.2 WWOX、p73、Bax表达与结直肠癌临床病理特征之间的关系 表2显示，WWOX在结直肠癌中的表达与浸润深度(χ2=6.169，P ＜ 0.05)及预后(χ2=9.893，P ＜ 0.01)密切相关，与年龄、性别及淋巴结转移无关(P＞0.05)。p73在结直肠癌中的表达与淋巴结转移(χ2=4.315，P ＜ 0.05)及浸润深度(χ2=4.207，P ＜ 0.05)相关，而与患者的年龄、性别及预后无关(P＞0.05)。Bax在结直肠癌中的表达与患者的预后相关(χ2=5.545，P ＜ 0.05)，与患者的年龄、性别、淋巴结转移及浸润深度无关(P＞0.05)。

表2 WWOX、p73及Bax的表达与结直肠癌临床病理特征之间的关系

2.3 结直肠癌组织中WWOX与p73及Bax表达的相关性 WWOX阳性表达的15例结直肠癌组织中有10例p73表达阳性，13例Bax表达阳性，χ2关联性分析表明WWOX与p73的表达无相关性(P＞0.05)，与Bax的表达呈正相关(P＜0.05)，见表3。

表3 结直肠癌组织中WWOX与p73、Bax表达的相关性

3 讨论

WWOX基因是Bednarek等［1］在2000年应用鸟枪基因测序技术结合对感兴趣区域对应的转录子进行分离并分析的方法鉴定得到的一个新的包含有FRA16D的基因，跨越了基因组内一个大于100万bp的区域，这个区域位于染色体的16q23.3～q24.1(普通型脆性位点，FRA16D)。

目前人们通过研究已经在肺小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鳞状上皮细胞癌等多种肿瘤中发现了WWOX的表达异常，推测WWOX基因为新的肿瘤相关基因［1～6］。本研究我们应用免疫组化方法检测了结直肠癌组织及结直肠黏膜炎症组织中WWOX蛋白的表达，结果显示WWOX在癌组织中的表达明显低于炎症组织，这与其他相关报道一致，提示WWOX蛋白的低表达可能在结直肠癌的发生发展中起了重要作用。另外，试验中我们发现WWOX在结直肠癌中的表达与肿瘤的浸润深度及患者的预后密切相关(P＜0.05，P＜0.01)。目前WWOX蛋白在人肿瘤中的详细作用机制还不清楚，但有研究表明在鼠的体内与WWOX基因功能及结构类似的基因(WOX1)已被证实是肿瘤坏死因子(TNF-α)介导的细胞凋亡过程中必不可少的中介物。WOX1位于细胞的线粒体内，TNF通过诱导线粒体膜通透性的改变导致WOX1从线粒体释放，促进细胞的凋亡。根据人和鼠间的高度同源性，我们分析当WWOX蛋白低表达甚至失活时，影响了TNF的作用过程，从而降低或丧失对细胞凋亡的控制，导致肿瘤的发生。

作为p53家族的成员之一，p73蛋白与P53蛋白在序列上具有同源性，也能够诱导细胞周期阻滞和凋亡。Jost等［7］将野生型p73转染SAOS2细胞后发现，细胞发生了明显的凋亡，而转染p73突变体的细胞株却没有这种现象。因此人们推测p73是一抑癌基因。然而最近的研究发现，p73在很多肿瘤组织中高表达，在相应的正常组织中低表达。Kang等［8］研究表明，在正常胃组织和4/5的研究细胞系中p73极低水平表达，但37/39的癌组织中p73明显升高。另外人们在肝细胞癌、肺癌等也检测到高水平表达的p73，但对其高水平表达的机制及其是否为抑癌基因仍不是很清楚。本次试验结果显示p73在结直肠癌组织中过度表达，显著高于炎症组，且与浸润深度成正相关(P＜0.05);在有淋巴结转移组p73阳性表达率也明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05)。我们认为，p73在结直肠癌中的过度表达与结直肠癌的发生发展密切相关，p73可作为结直肠癌淋巴结转移的一个重要指征。

Bax是Bcl-2家族中最重要的促凋亡蛋白，Bcl-2家族在细胞凋亡的调控中扮演了重要的角色。Sarbia等［9］对食管癌的研究显示Bax在食管癌的表达明显低于正常食管上皮，并且随着肿瘤分化程度的下降而减低。Marx等［10］检测了215例卵巢癌的Bax表达情况，发现Bax的阳性率为47%，明显低于正常组织。我们的结果和其他报道一致，同时我们发现Bax的表达与预后关系密切，高表达预示患者的预后好，生存期长。我们推测Bax基因的检测对于结直肠癌的预后诊断有一定的参考意义。

WWOX基因由9个外显子构成，其ORF长度为1245bp，编码一个长414个氨基酸，46kDa的蛋白［11］。研究发现WWOX蛋白可同多种蛋白相互作用。Aqeilan等［12］就报道了人的 WWOX可直接在胞浆中通过第一WW结构域与p73的482PPPP Y488基序互相作用，形成结合复合物产生促凋亡作用。本次试验显示WWOX与p73的表达无相关性(P＞0.05)。国外学者通过研究发现WWOX与p73共同转染时可增强细胞凋亡，单独转染也能引起细胞凋亡，由此推测在人体内应该存在一条独立于p73的关于WWOX促细胞凋亡的途径，在结直肠癌中WWOX可能主要通过该途径来发挥其对肿瘤细胞的促凋亡作用，因此在结直肠癌组织中两者未体现出相关性。

另外，有文献报道WWOX蛋白主要位于线粒体，WWOX通过下调凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-xl及上调P53的表达增强TNF的细胞毒性功能，而TNF通过促使线粒体通透性的改变而导致WWOX从线粒体释放入核内，起促凋亡的作用。Bax是Bcl-2家族中最重要的促进凋亡蛋白，此次研究发现WWOX与 Bax有协同作用(χ2=6.561，P ＜ 0.05)，我们推测WWOX可能通过上调Bax的表达等一系列相同的作用方式促进细胞的凋亡。因此联合检测两者在结直肠癌中的表达可能对其预后的诊断有着重要的作用。

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