维生素E对先天性膈疝大鼠模型胎仔肺发育及肺血管重构的影响

林 涵，王銮虹，刘文英，王学军，吉 毅，杨 纲

(1.汕头大学医学院第一附属医院小儿外科，广东 汕头 515041;2.汕头大学医学院附属肿瘤医院妇瘤科，广东 汕头 515031;3.四川省医学科学院·四川省人民医院儿童医学中心，四川 成都 610072)

经过多年的努力，先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)患儿的病死率仍然高达50%，其死亡的主要原因是肺发育不成熟(pulmonary hypoplasia，PH)和持续性肺血管高压(persistent pulmonary hypertension，PPH)。如何通过产前干预或者预防的方法，促进患儿的肺发育和改善其肺血管重构是提高该病存活率的关键。

1 材料与方法

1.1 模型建立与动物分组 汕头大学医学院动物实验中心提供的成年健康SD雌鼠20只，平均体重(248±11.5)g和6 只雄鼠平均体重(279±3.2)g ，2∶1夜间进行交配，次晨取阴道内容物涂片，以镜下检测到精子确定为妊娠，并以当日为妊娠第0.5 d计算妊娠时间，交配后共18只大鼠怀孕。孕9.5 d采用成组设计将孕鼠用简单随机法分为3组:对照组、膈疝组和干预组(各6只)。膈疝组和干预组给予除草醚(浙江化工二厂)125 mg/只(溶于2 ml橄榄油)灌胃;对照组给予等量橄榄油。至孕11.5 d，干预组在孕11 d给予维生素E(美国Sigma公司)140 mg/kg(溶于2 ml酒精)灌胃(1次/天，连续3天)，在维生素E服用过程中采用避光措施。膈疝组和干预组给予等量酒精。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及膈疝观察 雌鼠孕21 d在戊巴比妥(0.03 mg/g)麻醉下剖宫取出胎鼠，在电子分析天平上称重量记录体重后处死，经胸骨正中切口剖胸，取出两侧肺组织在电子天平上称重后在放大镜(4倍)下观察有无膈肌缺损，记录胎鼠膈疝的位置、疝孔大小和疝内容物。计算胎鼠肺重与体重之比(Lw/Bw)。

1.2.2 光镜标本制定及观察 取出胎肺用10%甲醛溶液固定，48 h后常规石蜡包埋，切片后行HE及弹力纤维染色，进行组织学观察(Nikon E600图像分析显微镜)。

1.2.3 组织学切片图像分析 应用spot V3.0图像采集软件和image-pro plus V4.10专业图像分析软件测定每个视野肺组织灰度值百分比［1］，反映肺泡与肺泡腔面积的百分比-肺泡面积比(PAA%)、肺泡间隔面积比(ASA%)及轴向腺泡计数(axial acinar count，RAC)。分别计算每个切片单位面积内腺泡前动脉(PAPA)和腺泡内动脉(intra-acine pulmonary arteries，IAPA)总数，分别测量计算其平均血管外径(ED)及平均中膜厚度百分比(MT%)。并计算肌型动脉(MA)、部分肌型动脉(PMA)、非肌型动脉(NMA)的数目及其所占的百分比。以上测定均用双盲法由同一操作者在×400倍光镜下完成。在取标本时，以相应光镜检测表明取材较理想者各组取3个标本作电镜检测，拟作电镜观察的肺标本用3.0%戊二醛固定48 h后备检。电镜观察使用日立H-600IV型透射电子显微镜观察及照相。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。实验数据以均数±标准差表示，数据经方差齐性检验后，膈疝组和干预组致畸率的比较采用四格表资料率的比较的χ2检验。对各实验组的肺重/体重应用成组设计的秩和检验(方差不齐)进行统计学分析，并以Nemenyi法进行两两比较。其余指标参数检验方差齐性之后，采用成组设计的多个样本均数比较的单因素方差分析进行统计学比较，组间两两比较采用LSD检验法。各组间比较采用Student-Newman-Keuls法进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 对照组获得胎仔42只，无膈疝形成。膈疝组获得胎仔39只，有膈疝形成者26只，致畸率66.67%。干预组产胎仔41只，有膈疝形成者19只，致畸率46.34%。膈疝组和干预组的致畸率差异有统计学意义(P＜0.05)。膈肌缺损多位于左侧，疝内容物主要为小肠、胃和肝脏。

2.2 光镜观察

2.2.1 Lw/Bw和肺发育的形态学指标 Lw/Bw、轴向腺泡计数(RAC)、肺泡面积比例(Alveoli%)、肺泡面积比(PAA%)及肺泡间隔面积比(ASA%)等体现肺发育不良的形态学指标测定结果表明，维生素E能有效地改善肺组织发育，并增加肺重量/体重比值(mg/g)，与膈疝组相比差异有统计学意义，见表1。

表1 各组Lw/Bw(mg/g)和肺实质发育的形态学指标比较

2.2.2 HE染色肺形态观察 对照组肺泡结构明显，腺泡大，肺泡间质薄而均匀，呼吸性支气管末端呈囊泡状，肺小血管管壁菲薄，管腔大，中膜平滑肌细胞呈梭形，肌层肺组织发育成熟或接近成熟，整体外观呈肺泡期的肺形态。膈疝组肺泡小而少，间质厚，支气管末端囊泡状结构少见，肺小血管管壁明显增厚，血管腔狭窄，中膜平滑肌细胞增生，肌层肥厚，肺组织发育停滞于假腺体期。干预组均肺泡增大，肺泡间质变薄，肺小血管壁变薄，血管腔变大，介于两者之间，肺组织发育处于腺泡早期。

2.2.3 肺血管的改变 MT%的变化:膈疝组的MT%与对照组比较明显升高，其差异有统计学意义。维生素E可使除草醚引起膈疝的胎鼠之IAPA(肺腺泡内动脉)的MT%(中膜厚度)降低，差异有明显的统计学意义，见表2、图1。

表2 各组胎肺间质血管形态指标比较 (%)

2.3 电镜观察 与对照组相比，膈疝组的IAPA的内皮细胞变性肥大，平滑肌增生和胶原纤维显著增加;干预组的IAPA的内皮细胞轻度变性，平滑肌轻度增生，成纤维细胞增生明显，胶原纤维增加，见图2。

图1 肺腺泡内动脉MT%的变化 a:对照组，b:膈疝组，c:干预组;图2 胎鼠肺组织切片电镜观察EM×12000 a:对照组，b:膈疝组，c:干预组

3 讨论

目前CDH尚缺乏有效的病因治疗，CDH患儿死亡率高的主要原因是PH和PH［1，2］。PH和PPH在胚胎期已经发生，生后继续发育改善的能力有限，各种生后治疗手段也不能很好地改善肺发育不成熟和肺血管高压，因此目前研究的热点之一聚焦在如何通过产前用药改善胎肺发育上。糖皮质激素已被应用于PH的产前治疗，但其可干扰母体的内分泌系统并可能导致流产。故探索其他可能产前改善肺发育和肺血管重构的药物对CDH的治疗有重大意义。

维生素E是最主要的抗氧化剂之一，可保护其他易被氧化的物质，减少过氧化脂质的生成，保护机体细胞免受自由基的毒害，抑制脂质过氧化及形成自由基。机体在正常代谢过程中产生一定量的自由基，同时机体内存在着抗氧化作用的自由基清除剂如维生素E、C和硒等，正常情况下，两者呈动态平衡。当自由基产生过多或者抗氧化剂不足，此平衡系统失衡，都会导致机体发生疾病。如果自由基没有及时被抗氧化剂清除，就会与距其最近的脂肪、蛋白、碳水化合物RNA或者DNA等产生反应，改变它们的结构和功能［3］，导致机体产生疾病。维生素E能维持生物膜完整性和稳定性，有抗炎和增强免疫作用，能保护体内易被氧化的物质，提高红细胞膜、溶酶体膜的稳定性，维持和促进免疫细胞的正常功能，目前已被大量应用于治疗动脉粥样硬化和缺血性心脏病［4～6］。本实验采用维生素E对大鼠CDH模型进行产前干预并观察其疗效。

本实验采用除草醚诱导先天性膈疝大鼠模型，致畸率达50.70%，HE染色发现正常对照组外观呈肺泡期的肺形态，而膈疝组肺组织发育停滞于假腺体期，肺泡小而且数量少，肺泡间隔厚，肺实质呈假腺体样改变。干预组的肺组织发育处于腺泡早期。体现肺发育成熟的指标表明膈疝组肺发育不良，干预组的肺发育程度明显改善，表明维生素E能有效地改善肺发育不良。

IAPA系呼吸性细支气管至肺泡隔毛细血管前这一段肺动脉的总称，它包括MA、PMA、NMA三种不同的血管段，泡内肺动脉对血液灌注和阻力具有很大的缓冲能力，是控制肺动脉血流动力学的关键血管。近年来，有关肺腺泡内动脉构形重建与肺动脉高压形成之间的关系日益受到重视［7］。人类和大鼠膈疝肺血管高压的病理基础主要是肺血管横断面积减少，血管内侧壁增厚和腺泡内动脉异常肌化［8～10］。本实验中，膈疝组胎鼠 IAPA的 MT与对照组比较明显增厚，表明其血管内侧壁增厚和腺泡内动脉异常肌化。而在干预组中，肺腺泡内动脉的MT明显下降。维生素E可能主要通过抑制肺小动脉特别是IAPA的肌化减轻肺动脉高压。

本实验表明维生素E能改善先天性膈疝的肺发育不良及肺血管重构，目前其作用的机制尚不清楚，可能与其清除自由基的作用有关。目前临床上维生素E在推荐剂量下还未发现有明确的副作用，而维生素E在本实验的使用过程中，未发现服用的孕鼠有明确的不适症状。故在不影响效果的条件下，产前使用维生素E也许可以作为将来治疗先天性膈疝肺发育不良及肺血管重构的一种选择。

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