加减温经汤对寒凝血瘀模型大鼠子宫内膜ER、PR表达的影响

徐丁洁， 成秀梅， 杜惠兰*， 徐 洪

(1.河北医科大学中西医结合妇科教研室，河北石家庄050091;2.河北医科大学中西医结合外科教研室，河北石家庄050091;3.河北医科大学病理科，河北唐山063000)

寒证为八纲之一，妇科寒证是临床较为多见的病证之一。我们曾对1122名妇女进行流行病学调查发现，属月经病寒证者411人，占36.63%［1］。寒客冲任、胞宫，影响女性正常经孕。正常月经一方面依赖于下丘脑-垂体-卵巢轴调节功能正常，促使卵泡发育成熟，分泌雌、孕激素。另一方面，雌、孕激素须与子宫内膜组织中的相应受体结合，才能发挥其生理作用［2］。本实验通过研究加减温经汤对寒凝血瘀模型大鼠卵巢激素雌二醇(Estradiol，E2)和孕酮(Progesterone，P)水平及子宫内膜雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone Receptor，PR)表达的影响，探讨其治疗寒凝血瘀型妇科疾病的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，雌性，鼠龄3个月，体质量(190±10)g，由河北医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(冀)2008-1-003，合格证号1006025。

1.2 试剂 加减温经汤:当归10 g、川芎10 g、白芍10 g、肉桂10 g、莪术 10 g、丹皮 10 g、吴茱萸 10 g、怀牛膝 12 g、甘草6 g，一次性购于石家庄乐仁堂药业。首先将当归、川芎、莪术、肉桂、吴茱萸5种药物浸泡，然后加入8倍量的水，用蒸馏法提取挥发油，密闭保存。取药渣与浸泡的其他药物一起水煎3次，30 min/次，过滤，共得药液 1200 mL，离心、浓缩至含生药3.52 g/mL。将药液置4℃冰箱备用，用时取出，与挥发油混合，用蒸馏水稀释至所用浓度。

E2(批号RG60905)、P(批号RG50905)放免试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司。

一抗:ERα(SC-542)、PR(SC-538)(兔抗大鼠)工作液购自Santa Cruz Biotechnology。二抗:SP－9001兔 SP kit，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型DAB试剂盒，ZLI-9032，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 造模方法及分组 大鼠30只，适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、治疗组，每组10只。正常组常规饲养，另两组大鼠置于0～1℃冰水中20 min，1次/d，连续2周［3］。治疗组于造模的第1天开始，每日分别按29.32 g/kg(相当于临床成人剂量的20倍)给予加减温经汤灌胃，连续2周。

1.4 阴道上皮细胞检查 每日上午、下午各做阴道涂片一次，处死前2 d，每隔2 h涂片一次以确定动情周期，以0.5%的碱性美蓝溶液染色10 min，自来水轻轻洗去多余的染色液，待干，用普通光学显微镜观察。

1.5 取材方法 择动情期间断头取血，制备血清，放射免疫分析法检测E2、P。取子宫，吸去血迹，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，进行免疫组织化学染色，观察子宫内膜ER、PR的表达。

1.6 免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡到水。滴加0.1%的胰酶，37℃烤箱中孵育10 min。PBS冲洗，3 min×3次。3%H202去离子水室温孵育10 min。PBS冲洗，3 min×3次。10%正常山羊血清封闭非特异性抗原，37℃烤箱中孵育10 min，倾去，勿洗。滴加1∶200稀释的一抗，4℃过夜。PBS冲洗，3 min×3次。滴加生物素标记的二抗IgG，37℃烤箱中孵育10 min。PBS冲洗，3 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃烤箱中孵育10 min。PBS冲洗，3 min×3次。室温下DAB显色2～5 min。自来水终止显色，苏木复染，返蓝，脱水，透明，封片。

切片均在同一条件下按SP法进行免疫组化染色。用已知的阳性切片同时在同一条件下染色作为阳性对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.7 图像分析及统计学处理 每个组织随机选取1张切片进行分析，应用Image pro plus 6.0专业图像分析软件进行图像采集和分析。于每张切片随机选取6个视野，各采集1张200倍的图像，计算积分光密度(integral optical density，IOD)值，6张图像的IOD平均值作为该片指标的代表值。平均光度值越高，表达越强。

2 结果

2.1 动物一般状况 实验过程中，正常组和治疗组大鼠外观无明显差异，毛色白而光泽，精神状况佳，活泼，反应灵敏;模型组大鼠精神不振，毛色不荣，尾凉，少动、大部分出现腹泻。

2.2 动情周期的变化 根据阴道上皮脱落细胞［4］判断大鼠动情周期，分为动情前期、动情后期和动情间期。比较各组大鼠处死前最后一个动情周期各阶段时间的变化。

与正常组比较，模型组大鼠动情周期及动情间期延长，差异有统计学意义(均P＜0.05)，与模型组比较，治疗组大鼠动情周期及动情间期缩短，差异有统计学意义(均P＜0.05)，并且恢复至正常水平(均P＞0.05)。动情前期及动情后期各组之间比较差异无统计学意义(均P＞0.05)。见表1。

表1 各组之间动情周期比较(±s)

表1 各组之间动情周期比较(±s)

注:与正常组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05。

/d正常组组别 动物数/只动情周期/d动情间期/d动情前期/d动情后期10 4.1 ±0.4 1.4 ±0.3 1.5 ±0.4 1.7 ±0.5模型组 10 5.0 ±0.9* 2.1 ±0.5* 1.8 ±0.7 1.9 ±0.7治疗后 10 4.3 ±0.7# 1.7 ±0.4#1.7 ±0.5 1.9 ±0.6

2.3 血清E2、P值变化 与正常组比较，模型组血清 E2、P值降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较，治疗组血清E2、P值升高，差异有统计学意义(均P＜0.05)，并且均恢复至正常水平(均P＞0.05)。(见表2)

表2 各组之间血清E2、P值比较(±s)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05。

组别 动物数/只 E2/(pg·mL－1) P/(ng·mL－1)正常组10 41.32 ±15.02 4.87 ±0.79模型组 10 26.03 ±10.90* 3.62 ±0.61＊＊治疗组 10 38.64 ±13.73# 4.51 ±0.71#

2.4 子宫内膜ER、PR平均光密度值变化 与正常组比较，模型组子宫内膜ER、PR表达降低，差异有统计学意义(均P＜0.01);与模型组比较，治疗组子宫内膜ER、PR表达增强，差异有统计学意义(均P＜0.05)，ER表达恢复至正常水平(P ＞0.05)。(见表3)

表3 各组之间子宫内膜ER、PR平均光密度值比较(±s)

表3 各组之间子宫内膜ER、PR平均光密度值比较(±s)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05。

ER PR正常组组别 动物数/只10 253.86 ±26.72 207.84 ±23.66模型组 10 211.03 ±23.11＊＊ 163.22 ±18.78＊＊治疗组 10 236.81 ±24.43# 185.91 ±20.01*#

3 讨论

“妇人以血为本”，寒为阴邪，性主收引、凝滞，极易与血搏结。寒客冲任、胞宫，可使经脉拘挛，血行瘀滞，“不通则痛”，发为痛经;或冲任、胞脉被阻，胞宫不能按时满盈，而导致月经后期月经过少、闭经、不孕症等。根据“寒者热之”、“结者散之”的治则，我们拟定温经散寒、活血化瘀调经之加减温经汤。前期临床及实验研究已证实本方可通过改善生殖内分泌激素、调节致痛及镇痛物质，改善卵巢功能，治疗寒凝血瘀型妇科疾病［5-8］。本实验从子宫内膜受体方面进一步完善其作用机制。

正常妇女的月经周期中，子宫内膜ER、PR呈周期性变化，在增殖期雌激素促进子宫内膜 ER、PR的合成，ER、PR含量逐渐增加，于增殖末期达高峰。在分泌期，由于孕激素抑制子宫内膜ER、PR的合成，子宫内膜ER、PR含量均下降［2］。子宫内膜ER、PR的异常表达将影响E2和P值对内膜的发育、合成和分泌功能，影响子宫内膜生长［9-10］。女性激素水平及子宫内膜组织中相应受体含量任一方面减低或功能异常，都可使子宫内膜发生形态或功能的改变，继而影响妇女正常的经孕过程［11-13］。

本实验结果显示，寒凝血瘀模型组大鼠外观及精神均欠佳。阴道细胞虽呈周期性变化，但表现为动情周期延长，主要是动情间期延长。模型组大鼠血清E2、P值较正常组明显下降，子宫内膜ER、PR表达亦降低;经加减温经汤治疗后，血清E2、P值水平升高，子宫内膜ER、PR表达增强，且血清E2、P值及子宫内膜ER表达恢复至正常水平。表明加减温经汤可调节卵巢激素水平，增强子宫内膜ER、PR的表达，修复寒邪对子宫内膜的损伤，调节HPOA，使其达到一种平衡状态，综合作用下达到治疗寒凝血瘀型妇科疾病的目的。本实验卵巢激素水平、子宫内膜受体表达从两方面，揭示了寒凝血瘀型妇科疾病发生的生物学机制，完善了加减温经汤治疗寒凝血瘀型妇科疾病的机理。

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